蛋白分析FAQ彙總
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• 關於質量誤差"ppm":這個誤差是什麼意思?它在DIA中通常比MS1高嗎?
它是指:觀察到的質荷比(m/z)- 計算的質荷比(m/z)。沒有一項研究研究表明它在MS/MS中的平均水平高於MS1。 相關服務: DIA定量蛋白質組學
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• 在連續分析大量臨床樣品時應該多久用強洗脫溶劑沖洗色譜柱以避免晚洗脫汙染物導致的訊號抑制,或者應該使用梯度每次進樣後洗脫?
這必須在方法開發和驗證期間確定,並且非常依賴於方法--將直接與特定的化合物、提取方法和基質相關。例如,蛋白質沉澱法會產生比液-液萃取法更復雜的提取物。 相關服務: 樣品處理
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• DIA和DDA兩者優缺點是什麼?另外:建議使用MSconvert或任何其他軟體進行轉換嗎?或者建議的設定嗎?
轉換是透過使用質心來減小檔案大小。爲了保持一致性,DIA 檔案最初也是 mzXML 格式。然而,mzXML比 mzML丟棄更多的資訊,在這種情況下,mzXML沒有編碼隔離視窗的辦法,而只有一個前導質荷比(m/z),它可能是隔離視窗的中心,但在某種情況下如果您有 64 個可變隔離視窗,則隔離視
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• 構建離子庫:是否建議讓每個 DDA 都以與 DIA 相同的 LC 梯度執行?如果使用iRT呢?是否需要iRT?
爲了獲取最佳結果,您希望iRT測量值儘可能與實驗性DIA測量值相匹配。經常使用“色譜庫”方法,其中 DIA 搜尋庫是在相同條件下在同一列上獲取的,並且與實驗資料接近。這種方法總是使保留時間差得分成為一個非常有力的指標,你對實際使用的色譜進行iRT評分的距離越遠,你對保留時間的預測就越難。你可
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• 用什麼工具來生成 pep.xml檔案?Skyline還採用哪些其他格式的檔案?用PD進行搜尋.msf 格式檔案可以嗎?
Skyline採用了我們所接觸到的所有格式,可以處理.msf 格式和.pdResult格式資料檔案。 相關服務: DIA定量蛋白質組學
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• 基於生物標誌物的蛋白質組學鑑定,應該選擇 DDA 還是 DIA?
對於 DDA,您可能需要TMT或MS1色譜圖提取工具,如MaxQuant 或Mascot Distiller(或Skyline)。而且,您需要決定是使用需要試劑的等壓標記方法(如TMT標記),還是使用色譜峰面積的無標記方法。如果是後者,那麼無標記MS1方法可以更容易與無標記 DIA 進行比較
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• 構建您所選生物體的肽庫(透過對源自純細菌培養物的肽進行實驗)有多重要?是否有用於派生此類庫的推薦途徑?
我們建議您在獲取必要的DDA搜索結果後,使用Skyline構建庫,而不是使用SpectraST和工具來生成製表符分隔的“分析庫”。 相關服務: DIA定量蛋白質組學
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• 三氟乙酸(TFA)是否僅用於調節緩衝液中的 pH 值? 如果緩衝液的 pH 值允許,TFA 的濃度越低越好?
1.三氟乙酸(TFA)可以作為離子對,濃度通常在0.05-0.1%左右。濃度過高會使溶液過酸,影響色譜柱的使用時間。 2.同時,TFA可以在矽膠表面佔據矽烷醇基團,改善鹼性化合物的峰形。 如果使用 0.1% TFA 有時分離效果不好,可以嘗試 0.2% TFA,但使用後需要立即沖洗色譜柱。
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• 為什麼選擇差異凝膠電泳2D-DIGE進行定量蛋白質組學分析,而不是2D凝膠?
在2D-DIGE(two-dimensional difference gel electrophoresis差異凝膠電泳)中,我們使用熒光染料對蛋白質進行標記,從而能夠在一張凝膠中進行3個樣品的測定。與傳統的2D凝膠相比,2D-DIGE有許多優勢: 更高的靈敏度:熒光染料的靈敏度為0.2n
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• 差異凝膠電泳2D-DIGE進行定量蛋白質組學分析的靈敏度如何?
差異凝膠電泳2D DIGE 的靈敏度約為 0.2 ng/spot。 相關服務: 二維凝膠電泳服務
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