LC-MS/MS蛋白全序列驗證

隨著現代醫藥工業的進步，序列分析已成為蛋白質、多肽、抗體、疫苗類生物藥物分子以及膠原蛋白等醫療器械類產品的研發和質量控制中的重要環節。蛋白質的全序列驗證分析扮演關鍵角色，能夠確認重組蛋白質多肽類生物製品的完整準確表達，確保產品質量和有效性。




百泰派克生物科技BTP基於CNAS/ISO9001雙重質量認證體系，建立蛋白測序平臺，該平臺配備多臺N端序列分析儀、超高效液相色譜高分辨質譜聯用、經過多輪最佳化的蛋白從頭測序演算法平臺。結合先進的分析裝置和演算法，BTP能夠對蛋白質進行全序列驗證分析，確保蛋白質的完整性和準確性，以滿足您的研究和質量控制需求。

 

液質聯用（LC-MS/MS）蛋白全序列驗證分析:

 

蛋白全序列驗證分析的一般流程是使用特異性蛋白酶對蛋白質分子進行酶解切割，酶解後的供試品是複雜的肽段組成的混合物，然後透過液質聯用平臺對供試品進行質譜分析。




首先，是對樣本進行前處理，即根據蛋白全長理論氨基酸序列結合質譜級別蛋白酶酶切位點資訊選擇至少五種蛋白酶對蛋白進行酶切，提高酶切效率，以便獲得更高的覆蓋度。實際實驗中可以從多種蛋白酶（Trypsin、Chymotrypsin、Asp-N、Glu-C、Lys-C和Lys-N等）中選擇合適的蛋白酶或者組合酶切的方式對靶蛋白進行酶切；其次，使用液質聯用Nano-LC-MS/MS 平臺對酶切之後的肽段混合物進行分析，得到總離子流色譜圖和質譜原始資料；然後，以所測定蛋白的理論序列建立本地資料庫，透過專業分析軟體匹配並計算每一種酶切之後鑑定到的肽段；利用酶切位點之間的互補性對蛋白序列進行拼接，最終實現蛋白全序列驗證。

 

案例示意圖:

 



抗體輕鏈全序列驗證分析示意圖

 

一般流程：




1、使用多種蛋白酶組合酶切的方式對蛋白進行酶切，提高酶切效率，以便獲得蛋白每一個氨基酸的序列資訊。

2、使用 Nano-LC-MS/MS 液質聯用高分辨平臺對樣品進行分析。

3、將得到的質核比資訊與理論序列建立的資料庫進行比對。

4、拼接每種酶切方式鑑定到的肽段，得到蛋白是否完整正確表達的資訊。




實驗儀器:

 

• 液相色譜儀（Easy-nLC1200）
  
  
• 電噴霧-組合型四級杆-Orbitrap 質譜儀（Q Exactive™ HybridQuadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer ）

 

應用:

 

• 蛋白質、多肽、抗體、疫苗、膠原蛋白等生物製品的氨基酸全序列驗證分析
• 蛋白質翻譯後修飾和化學修飾分析
• 蛋白質、多肽、抗體、疫苗、膠原蛋白等生物製品的氨基酸序列突變分析

 

常見問題:




問題1：覆蓋度能反映什麼問題呢？若覆蓋度不足100%該怎麼處理？

回答：覆蓋度是指被測序到的序列佔全序列大小的比率。反應了我們的測序結果對於我們蛋白的覆蓋情況，若覆蓋率為100%代表樣品經酶解處理之後得到的序列與目標序列高度吻合，若覆蓋率不足100%，我們會審查蛋白質資料和序列，檢視缺失多少序列以及哪些理論上的肽段未檢測到；根據實際結果判斷是否繼續使用現有方法和酶解處理，重新獲得肽遺失的位置，還是蛋白樣品本身發生了突變，需要進行從頭測序分析。 

 

問題2：想要進行測序的蛋白質分子量較小，如何進行蛋白樣品製備？

回答：如果蛋白分子量比較小，可以使用濃度較高的SDS-PAGE膠將蛋白質進行分離，然後對蛋白膠進行考馬斯亮藍染色，再將與目的蛋白大小一致的蛋白條帶切割下來，切下來的蛋白膠條用於質譜鑑定。

 

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