蛋白分析FAQ彙總
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樣品推薦: 建議樣品體積中至少含有300pmol的蛋白質,在30μM的濃度下,體積約10μL,當然樣品中所含蛋白質越多越好。樣本應該是純的,否則解摺積可能不起作用。 去汙劑與質譜不相容,必須在分析前從緩衝液中除去。去除緩衝液中的所有聚合物或去汙劑(例如TritonX、NP-40、SDS或類似
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如果您的蛋白樣品只含單一蛋白質或含多達50個等摩爾質量的蛋白,並且需要進行蛋白質鑑定,則30分鐘的執行時間就足夠了。 如果您是IP樣品,並期望檢測出約100種蛋白質,那麼我們建議60分鐘的執行。 如果您期望尋找翻譯後修飾位點(PTM),我們建議至少執行60分鐘。 如果您的樣品是含有數百種蛋白
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對於單個蛋白凝膠條帶: 採用小型凝膠進行電泳並進行考馬斯亮藍染色。也可以使用SYPRO™ Ruby進行染色,但銀染條帶可能不能涵蓋足夠的蛋白質用於鑑定。透過與已知濃度的標記物進行比較來預估條帶中的蛋白含量。染色時間不得超過15分鐘。如果將凝膠染色太久,染料碎片會影響後續脫鹽步驟。用乾淨的手術
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我們需要您提供修飾後增加的確切質量以及目標蛋白的確切序列。相關服務:蛋白質翻譯後修飾
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• 在研究磷酸化、乙醯化等翻譯後修飾(PTM)時,如何製備樣品?
對於這類研究專案,我們通常採用3種酶的方法開展。即用3種不同的酶進行消化,以確保全範圍覆蓋。我們要求使用者對感興趣的目標條帶進行3個泳道的電泳,並將3個泳道的蛋白條帶收集到一個試管中。相關服務:蛋白質翻譯後修飾
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• 如果想要進行N端/C端測序或蛋白質修飾鑑定,對樣品有什麼要求?
我們需要您提供樣品蛋白所有標籤和修飾的確切序列。相關服務:蛋白質N/C端測序
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對於溶液內消化樣品的LC-MS/MS分析,所需的樣品蛋白是基於BSA校準的Bradford法測定蛋白質的10倍,當然,也可以減少蛋白加樣量,即在每次執行時將1 ug總蛋白注入到檢測系統中,但由於製備過程中的樣品損失而需要超量。 對於凝膠條帶,如果是考馬斯染色的凝膠上的可見條帶,我們的陽性識別
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• 如何決定對裂解物或免疫沉澱物以溶液還是凝膠條帶形式的樣品進行分析?
對於Label free非標定量分析,我們通常使用溶液內消化來限制樣品間的變化量。用溶液樣品進行消化和後續分析,還可以最大數量的獲得蛋白定性“組分表”。該方法有助於避免因凝膠提取效率而產生的偏差,並在樣品很少的情況下提高樣品的原始靈敏度。因此,我們可以對蛋白質含量低至0.1 ug的樣品進行溶
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凝膠條帶 樣品應在4℃下儲存在含有50 mM AmBic或水溶液的1.5 mL eppendorf管中。 溶液 樣品應儲存於含有0.1-0.5%Waters RapiGest 質譜相容洗滌劑的50 mM碳酸氫銨中。相關服務:樣品處理
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• 定性鑑定免疫沉澱和/或標記的蛋白質樣品的未知磷酸化位點可以直接使用SDS-PAGE凝膠樣品進行研究嗎?還是使用溶液樣品?
用溶液樣品開展研究是首選方法;但是,如果需要,也可以直接從SDS-PAGE凝膠條帶樣品中進行分析。 *注意:磷酸酶抑制劑(如 KF 和原釩酸鈉)可以與LC-MS富集技術相容,這些成分應在樣品預處理過程加入。相關服務:磷酸化定量蛋白組學
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