蛋白分析FAQ彙總

• • 我感興趣的蛋白質在純化過程中“消失”了，我該怎麼辦？

  1.蛋白質可能被蛋白酶降解了。解決方法：向樣品和緩衝液中新增蛋白酶抑制劑，以防止蛋白水解消化。透過Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow等介質執行樣品以除去胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。 2.在樣品製備過程中，蛋白質被吸附到過濾器中了。解決方法：使用不同膜型別的過濾器。

• • 為什麼我的SEC的解析度很低？

  許多因素都會影響尺寸排阻色譜（SEC）的解析度，例如介質的粒度、色譜柱長度和樣品體積。 但另一個可能不太明顯的方面是液相色譜（LC）系統本身的貢獻。重要的是要儘量減少系統中的死體積，例如透過使用短而窄的管道並移除系統流路中所有不必要的元件。相關服務:蛋白質純度分析（分子篩/反相色譜）

• • western blotting和far-western blotting有什麼區別？

  蛋白質印跡（western blotting）用於檢測蛋白質，而far-western blotting用於檢測蛋白質-蛋白質相互作用。這是透過在western blotting中使用抗體進行蛋白質檢測，而在far-western blotting中使用蛋白質探針來完成的。在western

• • Co-IP和GST-pull down有什麼區別？

  免疫共沉澱（Co-IP）實驗是在非變性條件下進行的，可以最大限度地保持蛋白質之間相互作用的天然活性。因此，Co-IP可以很好地原位反映蛋白質的真實相互作用。然而，僅使用Co-IP，我們不能確定蛋白質相互作用是直接的還是間接的。透過靶蛋白抗體免疫共沉澱後，得到一種蛋白質複合物，它不僅含有與靶蛋

• • 免疫沉澱實驗中出現了非特異性結合怎麼辦？

  使用更嚴格的洗滌緩衝液進行洗滌。 向洗滌緩衝液中加入濃度在0.01-0.1之間的非離子洗滌劑（吐溫-20或Triton X-100）。 如果珠子在沉澱前被封閉，請在洗滌緩衝液中加入相同的封閉劑。 增加洗滌步驟數或延長洗滌步驟。 減少孵育時間（珠子和樣品）。 降低抗體濃度。 採用預清除步驟，以

• • 哪些型別的洗滌劑可以與LC-MS分析結合使用？

  大多數洗滌劑會導致色譜分離不理想。然而，這些化合物可能是最佳樣品製備所必需的。這正是我們在流程中實施使用洗滌劑去除柱的原因。您可以檢視色譜柱規格，瞭解可以安全使用的洗滌劑及濃度。相關服務:蛋白質質譜鑑定

• • 你們有下拉（pull down）實驗的流程嗎？

  有許多不同的選擇可以很好地進行下拉實驗。爲了對下拉的蛋白質進行最佳分析，我們建議選擇一種實驗設定，其中用於下拉的抗體保留在磁珠上而不會洗脫到樣品中。大量的抗體可以抑制被拉下的蛋白質的訊號。限制樣品中的抗體存在的方法有：將抗體共價結合到珠子上；使用溫和的洗脫緩衝液使抗體保持完整並結合在珠子上。

• • 在下拉（pull down）實驗中需要避免哪些緩衝液成分？

  在下拉實驗中使用NP-40等聚合物物質長期以來一直是其與LC-MS分析結合的一個大問題。聚合物電離化非常好，會干擾色譜分離和肽的電離。我們建議在實驗中避免使用NP-40。 如果無法做到這一點，使用Pierce detergent removal columns也有助於去除痕量聚合物，或者另一

• • 哪些電泳凝膠可用於質譜鑑定蛋白？

  聚丙烯醯胺凝膠效果很好。蛋白質分離可以是一維的，如SDS-PAGE，蛋白質按質量分離。也可以是二維的，如2D-PAGE，蛋白質按等電點在第一維中分離，按質量在第二維中分離。相關服務:蛋白膠點、膠條、IP樣品蛋白質鑑定

• • 哪些凝膠染色方法適用於蛋白質鑑定分析？

  使用任何型別的考馬斯藍非共價染料均可進行蛋白質鑑定分析。熒光染料，如Sypro Ruby和Deep Purple也是相容的。相關服務:蛋白膠點、膠條、IP樣品蛋白質鑑定