單細胞分析FAQ彙總

• • 單細胞轉錄組測序FastQC報告中，為什麼read2的duplication水平高低不定？

  10X單細胞轉錄組僅測序3’（或5’）端的150bp，不同的轉錄本可能對應相同的一個基因。且當某一個基因表達量很高時，對應得UMI計數會更高，而細胞數量又很大，所以duplication水平會很高。相關服務:單細胞測序

• • 為什麼單細胞樣本中線粒體的基因表達較高？

  線粒體基因在多數細胞中均有表達，其表達水平與細胞型別，狀態有關。高表達水平可能原因：1）樣本質量差，較多的細胞處於凋亡或溶解狀態，如果只是單個或較少cluster的細胞含有差異上調的線粒體基因和較低的總UMI count，這個cluster可能為死的 或凋亡的細胞。2）樣本的獨特性，如腫瘤或

• • 在Cell Ranger分析與cloup中，如何計算“Log2 Fold Change”？

  “Log2 Fold Change”是歸一化平均基因UMI計數，每個cluster或組中，相對於所有其他cluster或組的比值。由相應的公式進行計算。相關服務:單細胞測序

• • 什麼是測序飽和度？

  測序飽和度是在實驗中對文庫複雜度進行測序的分數。測序飽和度的反比可以解釋為一個新的read所能找到的新轉錄本的數量。如果測序飽和度為50%，則意味著每2個新的reads將檢測到1個新的UMI count (unique transcript)。相比之下，90%的測序飽和度意味著需要10個新的

• • 影響測序飽和度的因素有哪些？

  測序飽和度取決於文庫的複雜度和測序深度。不同的細胞型別有不同數量的RNA，因此最終文庫中不同轉錄本的總數也不同(也稱為文庫複雜性)。隨著測序深度的增加，可以檢測到更多的基因，但根據細胞型別的不同，在不同的測序深度，這一過程會達到飽和相關服務:單細胞測序

• • 使用10x Cell Ranger 鑑定cell的步驟？

  1、使用cutoff值，識別高RNA含量的細胞；2、選擇一組具有低UMI計數的barcode，表示“空 GEM”分割槽，建立背景模型。相關服務:單細胞測序

• • 差異基因展示中，小提琴圖怎麼看？

  小提琴圖反映了該cluster的細胞中，某一個基因的表達情況，及密度分佈。小提琴圖的最大寬度取決於給定cluster內基因在細胞內的表達丰度，與cluster內細胞數、cluster間細胞數差異無關；基因在cluster的大多數細胞表達為0，小提琴圖的最大寬度在基因丰度為0時實現，這樣高表達

• • Cell Ranger網頁版報告，第二頁差異基因的篩選規則是什麼？

  各cluster中差異高表達的基因，UMI count＞1，log2foldchang＞0，p-value≤0.1。 p-value：基於負二項檢驗，p值表示的是差異顯著性的度量，報告中顯示的p值是經過多次Benjamini-Hochberg校正的。相關服務:單細胞測序

• • Graph-based聚類方法的原理？

  Graph-based是基於圖的聚類演算法，透過構建稀疏鄰近的圖，然後在圖中尋找高度連線的Louvain演算法。k值是細胞數量值取對數得到；在聚類的過程中，若cluster中沒有差異基因，則會進行進一步的層次聚類，直到沒有可以合併的cluster。可以理解為系統自動分群。相關服務:單細胞測序

• • K-Means聚類的原理？

  k-means的演算法是將資料構建k個子集，然後計算每個類的中心點，向中心點聚集，直到聚類結果不再變化時停止，可以理解為人為規定手動進行分群。分析流程預設K-means為10，最大可以做到50。相關服務:單細胞測序