蛋白分析FAQ彙總
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• 確定蛋白質是否存在磷酸化的最佳方法是什麼?你們能定位我的蛋白質上的磷酸化位點嗎?
在可行的情況下,完整的蛋白質分析是確定蛋白質是否具有任何磷酸化的一個好方法,其水平可能高於未修飾蛋白質的 5% 或 10%。完整分析需要皮摩爾量的蛋白質,並且蛋白質必須非常純。蛋白質消化後進行 nanoLC/MS/MS 分析也是鑑定磷酸化的有效方法。MS/MS 測序用於定位磷酸化位點。相關服
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對於完整蛋白質分析,蛋白質樣品不含任何數量的去汙劑或聚合物尤為重要。對於基於蛋白質消化的溶液樣品中的蛋白質鑑定,蛋白質樣品不包含去汙劑、聚合物並且未暴露於胰蛋白酶抑制劑(如 AEBSF)或其他衍生試劑也很重要。相關服務:蛋白分析
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• 對於使用化學發光的多種蛋白質檢測,為什麼不能使用同一物種的多種特異性抗體,然後再為該物種提供二級抗體?
如果你有相同的物種,二級抗體將結合兩種蛋白質,你無法區分訊號或蛋白質。然而,如果蛋白質條帶非常明顯(沒有非特異性條帶)且大小分離良好(大蛋白和小蛋白),則可能使用相同的物種,但通常不建議使用。相關服務:蛋白質免疫印跡和電轉移服務
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• 在多重檢測的情況下,直接標記第三抗體的最佳(和最簡單)方法是什麼?
如果有合適的二級Ab可用,建議標記該二級Ab。在蛋白質高度表達的情況下,也可以標記初級抗體。當只有一個初級抗體時,訊號會變弱,因為沒有從次級抗體獲得放大效果(幾個次級抗體與每個初級抗體結合)。相關服務:蛋白質免疫印跡和電轉移服務
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當進行標記時,重要的是在蛋白質和CyDye量之間保持正確的平衡,以獲得對蛋白質(IgG)影響最小的有效標記。標記試劑盒和方案的設計對抗體效能的影響最小,只要遵循有關蛋白質和CyDye量的建議,就不會對抗原-抗體結合產生任何負面影響。相關服務:蛋白質免疫印跡和電轉移服務
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• 初始成像後可以將熒光團儲存在-20℃嗎?冷凍後熒光團是否穩定?
熒光團在膜上通常是穩定的(最多3個月),但不建議冷凍儲存。可以將薄膜乾燥,並將其避光室溫儲存(在濾紙或鋁箔包裹的薄紙之間)。相關服務:蛋白質免疫印跡和電轉移服務
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熒光檢測與用於高靈敏度化學發光試劑相比需要更高濃度的一級和二級抗體。最佳稀釋度因抗體而異,取決於樣品中目標蛋白的含量。相關服務:蛋白質免疫印跡和電轉移服務
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抗體溶液建議最好現配現用。至少要保證不重複使用二級抗體。對於一級抗體,如果沒有汙染可以重複使用。相關服務:蛋白質免疫印跡和電轉移服務
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• 是否存在一抗與熒光團偶聯的這種事情?如果存在這種情況,是否意味著二抗不再有用?
有一些用熒光基團標記的一抗可用,當然也可以標記一抗,如果使用標記的原代Ab,則不需要任何二抗。相關服務:蛋白質免疫印跡和電轉移服務
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• 在使用一種以上一抗的情況下,一抗或二抗孵育的順序是什麼?它們是一次孵化一個還是一次全部孵化?
可以同時孵育兩種抗體,這樣可以節省時間,也可以逐個進行。相關服務:蛋白質免疫印跡和電轉移服務
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