蛋白質定量技術及其在臨床研究中的應用
蛋白質組學代表了某些細胞、組織或器官的表達、翻譯後修飾以及蛋白質-蛋白質相互作用，已成為我們瞭解人類疾病和癌症分子機制和訊號轉導的重要手段。人體中的蛋白質水平處於穩定的平衡狀態，蛋白質的積累通常會導致生物體質的變化，從而導致腫瘤發生或疾病。因此，蛋白質定量對於機理研究具有重要意義。本文就目前流行的蛋白質定量技術及其在臨床研究中的應用作一概述。
基於HPLC-MS/MS的蛋白質組學技術
基於高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）的蛋白質組學技術的發展主要取決於液相色譜-質譜聯用分析裝置、樣品分離和製備技術、鑑定以及生物資訊學。目前，shotgun鳥槍法是最常用的大規模蛋白質鑑定策略。如下圖所示，在自下而上分析策略中，蛋白質透過蛋白水解酶水解成肽的混合物，然後透過色譜法或親和分離技術進行分離，最後透過質譜檢測碎裂離子。透過資料庫搜庫將質譜與資料庫中蛋白質理論消化產生的譜進行匹配，並根據一系列指標進行評分，實現肽譜匹配（PSM），並最終完成蛋白質組鑑定。而在基於自上向下的蛋白質組學分析策略中，可以直接從樣品中分離和檢測完整的蛋白。與自下而上的方法相比，自上向下分析策略能提供更多儲存蛋白物種的資訊。這兩種分析策略促進了疾病和癌症的蛋白質組學研究。
自下而上（a）和自上而下（b）基於質譜法的蛋白質組學工作流程（Jeong K等，2020）
蛋白質組學常用定量技術及其臨床應用
Label-free定量（LFQ）
Label-free非標記定量蛋白質組學分析技術由於簡單且侵入性最低而成為目前使用最廣的蛋白質組定量策略。該技術不涉及其他生物分子，既方便又經濟。但是，研究人員只能透過label-free定量方法獲得蛋白質的相對數量。Label-free定量在臨床研究中經常用於篩選腫瘤生物標誌物，通常將腫瘤鄰近組織或正常組織作為對照組。De Oliveira等人發現MMP-7是一種有前景的生物標誌物，與透過label-free定量結果有效診斷胃腺癌患者有關。尿E-鈣粘蛋白是發現糖尿病患者早期腎臟損傷的標誌物。在Sun等人的研究中，採用label-free定量分析系統地比較了健康受試者和肺癌患者唾液和血清外泌體中的蛋白質譜，並發現了潛在的肺癌生物標誌物。
真皮蛋白、載脂蛋白D、聚脂素、催乳素誘導蛋白和血清白蛋白是靶向蛋白質組學和無標記定量質譜研究中最豐富的汗液分泌蛋白，為形成面板化學屏障提供了潛在的汗液生物標誌物。label-free定量還用於檢測其他疾病和腫瘤的生物標誌物，如帕金森病的Vps35、肝細胞癌的SOAT1、前列腺癌的GOT2、膀胱癌的A1AT。
細胞培養穩定同位素標記技術（SILAC）
SILAC是一種體內代謝標記法，無論對蛋白質的絕對定量還是相對定量都具有較高的準確性和可靠性。SILAC法將賴氨酸（13C或15N）和精氨酸（13C或15N）的同位素新增到缺少賴氨酸和精氨酸的細胞培養基中，將蛋白質標記為輕型和重型。透過質譜檢測到的MS1水平進行定量分析，如下圖。Fricke等人使用SILAC定量檢測了TGFBR2缺乏性大腸癌中胞外囊泡的表達水平，發現了48個TGFBR2調控蛋白。SILAC策略常用於識別蛋白質和氨基酸的翻譯後修飾（PTM），例如，Peng等發現在肝細胞癌中，過表達RNF38可透過泛素化和降解AHNAK促進TGF-β訊號通路。Zhang等人透過SILAC定量比較了具有不同侵襲能力的食管鱗狀細胞癌的組蛋白H3和H4的翻譯後修飾，他們的研究有助於理解組蛋白翻譯後修飾在不同的侵襲性ESCC細胞系中的不同表達。隨著SILAC技術的發展，透過標記整個生物並將其組織用作內部標準品，實現了基於SILAC的模型生物組織定量蛋白質組學，從而闡明瞭SILAC在臨床研究中的應用。
SILAC的工作流程（Shenoy A等人，2015）
相對和絕對定量等重同位素標籤法（iTRAQ）
iTRAQ是由美國ABI公司於2004年開發的。依靠iTRAQ試劑盒，可以一次性標記多達8個樣品，iTRAQ試劑包含報告基團、肽反應基團和平衡基團。報告基團的分子量為113Da至121Da，相關的平衡基團的分子量為32Da ~24Da，總分子量為145Da。iTRAQ技術可以比較不同樣品中的蛋白質，具有良好的重現性和高靈敏度。可同時進行定性和定量分析。iTRAQ技術已在越來越多的領域中得到應用，如在醫學研究領域中，iTRAQ可以分析和鑑定腫瘤組織中的差異蛋白以尋找生物標誌物。Hjelle Sigrun闡述了iTRAQ在髓樣白血病分子治療靶標中的應用。Hu等人在肝損傷中鑑定了兩個標誌物，含量升高的膜結合的兒茶酚-O-甲基轉移酶（MB-COMT）和含量減少的視黃醇結合蛋白4（RBP4）。
串聯質量標籤（TMT）
TMT法由Thermo Fisher公司開發，TMT可以同時定量多達16個樣品。如下圖所示，TMT試劑也包含報告分子、標準化分子和胺反應性基團。TMT旨在在不犧牲蛋白質鑑定和蛋白質定量質量目標的情況下進一步增加能夠同時分析的樣品數量，並且其定量準確性更高。TMT也廣泛應用於臨床樣本研究，Wu等人應用TMT標記了10例HCC患者的樣本，發現纖溶酶原是HBV相關的慢性肝衰竭的預後生物標誌物。在胃癌、神經膠質瘤和膠質母細胞瘤的生物標誌物的發現中也可採用類似的分析策略。
除上述這些常用方法外，很多其他策略也可以用於定量蛋白質，例如差異凝膠電泳（DIGE）、同位素編碼的親和標記（iCAT）和SWATH。這些方法也可用於研究分子機制和生物標記。蛋白質定量技術對於尋找人類癌症的生物標誌物、藥物靶點選擇和機制研究至關重要。這些技術十分強大，可以幫助研究疾病發生和腫瘤進展的機制，以及發現新的生物標記並闡明臨床研究。
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