基於標籤的蛋白質定量技術-iTRAQ，TMT，SILAC
細胞中蛋白質組丰度的動態變化對各種生命過程都有重要影響。例如，許多疾病的發生和發展通常伴隨著某些蛋白質的異常表達。定量蛋白質組學是對一個基因組中表達的所有蛋白質或一個複雜混合系統中的所有蛋白質進行準確的定量和鑑定。目前，定量蛋白質組學技術主要分為標記策略和非標記策略，其中標記策略分為體內標記（如SILAC）和體外標記（如iTRAQ，TMT）。
iTRAQ的工作流程
iTRAQ技術的一般過程如下圖所示。簡要地說，樣品被胰蛋白酶裂解後，被烷基化並酶消化成肽段。用iTRAQ試劑的標記標籤對產生的肽段進行差異標記，然後將標記的樣品混合在一起進行LC-MS/MS分析。
iTRAQ的優勢
1. 在一次實驗中，iTRAQ可以同時標記4至8個樣品。操作簡單快捷。適用於多個樣品的高通量檢測，並且實驗設計更加靈活；
2. iTRAQ是在肽段水平上進行的體外標記，適用於許多型別的生物樣品；
3. iTRAQ具有重複性好、靈敏度高的特點，可以同時進行定性和定量。
TMT的工作流程
TMT的一般過程如下圖所示。將不同的蛋白質樣品變性、還原、烷基化並消化成肽段樣品。然後將這些肽段樣品用TMT試劑盒標記後合併爲一個樣品。使用HPRP液相色譜分離合並的樣品，並將餾分串聯為12個樣品。純化後，透過HPLC-MS分析每個樣品。分析資料以獲得蛋白質的定性和相對定量資訊。
TMT的優勢
1. 高靈敏度：可以檢測低丰度的蛋白質；
2. 分離能力強：可以分離酸/鹼蛋白、小於10KD或大於200KD的蛋白、不溶性蛋白等；
3. 應用範圍廣：可以鑑定任何型別的蛋白質，包括膜蛋白質、核蛋白質和胞外蛋白質；
4. 高通量：可以同時分析10個樣品，特別適合對採用多種處理方法或多種處理時間的樣品進行差異蛋白質分析。
SILAC的工作流程
SILAC的一般過程如下圖所示。向細胞培養基中新增輕、中或重穩定同位素標記的必需氨基酸（主要是賴氨酸和精氨酸），透過細胞的正常代謝，所有新合成的蛋白質都被標有穩定同位素。等量混合所有型別的蛋白質，透過SDS-PAGE分離、切膠和酶消化後，用LC-MS/MS分析可以獲得相關蛋白質的定量和定性結果。
SILAC的優勢
1. SILAC是一種活細胞水平的標記技術。標記效果穩定有效，標記效率不受裂解液的影響。
2. SILAC需要的樣品更少，通常每個樣品僅幾十微克的蛋白質就足夠了。
3. SILAC使用質譜法同時鑑定和定量多種蛋白質。
4. SILAC使用體內標記技術，接近樣品的真實狀態。
參考文獻
1. Zieske Lynn R. A perspective on the use of iTRAQ reagent technology for protein complex and profiling studies. Journal of Experimental Botany, 2006, 57(7):1501-1508.
2. Lichao Zhang, Joshua E. Elias. Relative Protein Quantification Using Tandem Mass Tag Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology, 2017, 1550:185.
3. Esthelle Hoedt, Guoan Zhang, Thomas A. Neubert. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture (SILAC) for Quantitative Proteomics. Adv Exp Med Biol. 2014, 806:93-106.
相對定量和絕對定量等壓標籤（iTRAQ）
iTRAQ是AB SCIEX公司於2004年開發的一種定量蛋白質組學研究技術。該技術可以比較許多不同樣品中的蛋白質。例如，它可以研究不同病理條件或不同發育階段的組織樣品中蛋白質表達水平的差異。同時，iTRAQ可以準確地定量和鑑定一個基因組中表達的所有蛋白質或一個複雜混合系統中的所有蛋白質。iTRAQ可以使用8種不同的同位素試劑同時標記和比較8種不同的蛋白質樣品。標記試劑由報告基團，平衡基團和胺特異性反應基團組成。iTRAQ的工作流程
iTRAQ技術的一般過程如下圖所示。簡要地說，樣品被胰蛋白酶裂解後，被烷基化並酶消化成肽段。用iTRAQ試劑的標記標籤對產生的肽段進行差異標記，然後將標記的樣品混合在一起進行LC-MS/MS分析。
四種不同樣品（S1-S4）多重反應的一般方案，用四種不同的顏色表示（Zieske et al.,2006）
iTRAQ的優勢
1. 在一次實驗中，iTRAQ可以同時標記4至8個樣品。操作簡單快捷。適用於多個樣品的高通量檢測，並且實驗設計更加靈活；
2. iTRAQ是在肽段水平上進行的體外標記，適用於許多型別的生物樣品；
3. iTRAQ具有重複性好、靈敏度高的特點，可以同時進行定性和定量。
串聯質量標籤（TMT）
TMT是美國Thermo Fisher Scientific開發的一種肽體外標記技術。該技術最多可以使用10個同位素標籤來標記多肽的氨基。經過LC-MS/MS分析後，可以同時比較10個不同樣品中蛋白質的相對含量。TMT廣泛用於疾病標誌物篩選、藥物作用靶標、動植物抗病或抗逆機制、動植物發育和分化機制等領域。TMT的工作流程
TMT的一般過程如下圖所示。將不同的蛋白質樣品變性、還原、烷基化並消化成肽段樣品。然後將這些肽段樣品用TMT試劑盒標記後合併爲一個樣品。使用HPRP液相色譜分離合並的樣品，並將餾分串聯為12個樣品。純化後，透過HPLC-MS分析每個樣品。分析資料以獲得蛋白質的定性和相對定量資訊。
使用10plex TMT進行相對定量的流程（Zhang et al.,2017）
TMT的優勢
1. 高靈敏度：可以檢測低丰度的蛋白質；
2. 分離能力強：可以分離酸/鹼蛋白、小於10KD或大於200KD的蛋白、不溶性蛋白等；
3. 應用範圍廣：可以鑑定任何型別的蛋白質，包括膜蛋白質、核蛋白質和胞外蛋白質；
4. 高通量：可以同時分析10個樣品，特別適合對採用多種處理方法或多種處理時間的樣品進行差異蛋白質分析。
細胞培養中氨基酸的穩定同位素標記（SILAC）
SILAC是用於高通量定量蛋白質組學的有效方案，它是根據依賴於必需氨基酸的哺乳動物細胞增殖的原理設計的。SILAC用於定量蛋白質組學研究，可以分析細胞中的蛋白質相互作用和蛋白質表達差異，為複雜的哺乳動物細胞蛋白質組學的全面系統的定性和定量分析提供有效的解決方案。SILAC的工作流程
SILAC的一般過程如下圖所示。向細胞培養基中新增輕、中或重穩定同位素標記的必需氨基酸（主要是賴氨酸和精氨酸），透過細胞的正常代謝，所有新合成的蛋白質都被標有穩定同位素。等量混合所有型別的蛋白質，透過SDS-PAGE分離、切膠和酶消化後，用LC-MS/MS分析可以獲得相關蛋白質的定量和定性結果。
使用SILAC進行蛋白質定量（Esthelle et al.,2019）
SILAC的優勢
1. SILAC是一種活細胞水平的標記技術。標記效果穩定有效，標記效率不受裂解液的影響。
2. SILAC需要的樣品更少，通常每個樣品僅幾十微克的蛋白質就足夠了。
3. SILAC使用質譜法同時鑑定和定量多種蛋白質。
4. SILAC使用體內標記技術，接近樣品的真實狀態。
參考文獻
1. Zieske Lynn R. A perspective on the use of iTRAQ reagent technology for protein complex and profiling studies. Journal of Experimental Botany, 2006, 57(7):1501-1508.
2. Lichao Zhang, Joshua E. Elias. Relative Protein Quantification Using Tandem Mass Tag Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology, 2017, 1550:185.
3. Esthelle Hoedt, Guoan Zhang, Thomas A. Neubert. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture (SILAC) for Quantitative Proteomics. Adv Exp Med Biol. 2014, 806:93-106.
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