如何最佳化蛋白質印跡的抗體濃度？
每個蛋白質印跡實驗都涉及在不同條件下與獨特樣品相互作用的獨特抗體。沒有一種抗體或抗原濃度適用於每個實驗。爲了獲得最完美的蛋白質印跡，需要最佳化抗體濃度。理想的抗體濃度取決於抗原濃度、抗體的特異性和親和力以及緩衝液組成等實驗條件。次優抗體濃度會導致幾個常見錯誤包括弱訊號、非特異性條帶以及斑點或斑點背景。最佳化抗體濃度可以解決這些問題以及更多問題，但執行多次蛋白質印跡以獲得最佳濃度既耗時又浪費。一種更簡單、更快捷、更便宜的方法是改用斑點印跡法。1、使用您選擇的緩衝液製備一系列蛋白質樣品稀釋液，並製備抗體稀釋液。2、將硝酸纖維素膜切成 1 釐米長的條狀，足以用兩個或三個二抗稀釋液測試一或兩個一抗稀釋液。3、使用盡可能少的體積將您的樣品點在硝酸纖維素膜條上。要點樣大於 5ul 的樣品，請在同一點多次點小體積，讓每個點每次都完全乾燥。打點完成後，讓膜條幹燥 10-15 分鐘。4、透過在室溫下浸泡在封閉緩衝液中 1-2 小時來封閉膜。使用振動篩確保覆蓋均勻。5、應用一抗稀釋液，在軌道振盪器上孵育 1 小時。接受相同濃度一抗的條帶可以在同一浴槽中一起孵育。6、在洗滌緩衝液中徹底清洗膜條。以與以前相同的方式應用二抗稀釋液。7、再次清洗膜條，如第 6 步。8、根據您正在使用的基材的資料表中的說明，準備基材工作溶液。9、將硝酸纖維素條與底物工作溶液一起孵育 5 分鐘，或直到出現顏色。10、使用化學發光底物時，觀察結果或用膠片或相機成像。最佳蛋白質濃度會產生黑點或持續 5-20 小時的強化學發光訊號。
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