怎麼對蛋白膠條進行測定?
在蛋白膠電泳後,通常利用質譜技術進一步分析和表徵特定的蛋白帶,主要流程如下:
1.膠條切割:
從待測蛋白膠條中選擇一均勻的部分或全長,避免選擇有明顯損傷或異常的部分。按照需要將蛋白膠條切成適當的尺寸。
2.蛋白消化:
將切割下來的膠塊進行處理以使蛋白質還原和泛乙醯化,並使用特定的酶,如胰蛋白酶,進行消化,將蛋白質切割成較小的多肽片段。
3.質譜分析:
經消化的多肽被提取並透過液相色譜與質譜儀(LC-MS/MS)進行分析。質譜儀可以識別出這些多肽的質量和序列資訊。
4.資料分析與蛋白質鑑定:
質譜資料透過生物資訊學工具和蛋白質資料庫進行匹配,實現原始蛋白質的定性定量確定。常用的軟體有Mascot、SEQUEST、MaxQuant等。
5.驗證:
有時,爲了驗證質譜的結果或進行定量分析,可以使用如Western Blotting的方法來進一步確認蛋白質的身份或表達水平 。
質譜分析能獲取多種蛋白資訊,包括分子量、氨基酸組成和序列、翻譯後修飾情況以及含量等,不論是1D-SDS PAGE分離的蛋白膠條還是2DE PAGE中的蛋白膠點,都能利用質譜技術進行鑑定。
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