用GST融合蛋白轉染進293T細胞,將細胞用裂解液裂解。用谷胱甘肽瓊脂糖珠純化,洗脫後用western blot分析可以嗎?
你描述的GST pull-down實驗的方法是可行的,具體步驟包括:利用GST融合蛋白轉染293T細胞,透過裂解液裂解細胞,利用谷胱甘肽瓊脂糖珠純化GST融合蛋白以及可能與其相互作用的蛋白,然後用Western blot方法進行分析。詳細的步驟如下:
1.轉染293T細胞:
透過將帶有GST標籤的目標蛋白的質粒DNA轉染到293T細胞中。
2.裂解細胞:
轉染後的細胞用含有對蛋白酶抑制劑的裂解液裂解,以把細胞內的蛋白釋放出來。
3.純化GST融合蛋白:
利用谷胱甘肽瓊脂糖珠可以將GST融合蛋白從裂解液中純化出來,此過程也可能將與GST融合蛋白有相互作用的蛋白一併純化出來。
4.洗脫:
使用含有谷胱甘肽的溶液洗脫與珠子結合的GST融合蛋白以及可能的相互作用蛋白。
5.Western blot:
透過Western blot方法對純化後的樣品進行檢測,既可以檢測GST融合蛋白,也可以透過特定的抗體檢測可能的相互作用蛋白。
需要注意的是,一些具體的實驗條件可能需要根據你的目標蛋白和預期的相互作用蛋白來進行最佳化,例如裂解液的組成、洗脫緩衝液的谷胱甘肽濃度、以及Western blot的抗體等。
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