你好，看您發了關於磷酸化和普通蛋白WB做法的不同，能麻煩您發一份磷酸化wb步驟嗎？

磷酸化Western Blot（WB）的步驟主要包括以下幾個部分：樣品製備，SDS-PAGE，轉膜，封閉，抗體孵育以及檢測。在磷酸化WB中，通常還需要進行一些特殊步驟以防止蛋白質去磷酸化。




1.樣品製備：

提取含有目標蛋白的細胞或組織樣本。爲了防止蛋白質去磷酸化，通常需要新增磷酸酶抑制劑。




2.SDS-PAGE電泳：

使用聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將樣品中的蛋白質根據大小分離。




3.轉膜：

將SDS-PAGE凝膠上的蛋白質轉移到膜上，通常是聚偏二氟乙烯（PVDF）或硝酸纖維素膜。




4.封閉：

使用封閉液（例如，牛血清白蛋白BSA或無脂牛奶）封閉膜上的非特異性位點，防止非特異性抗體的結合。




5.一抗孵育 ：

首先用特異性抗磷酸化蛋白的初級抗體孵育膜，通常孵育一晚的時間。




6.洗滌：

使用TBST緩衝液對膜進行洗滌，去除非特異性結合的一抗。




7.二抗孵育：

將與一抗匹配，且標記了熒光或者酶的二抗新增到封閉液中，通常孵育1-2小時。




8.洗滌：

再次用TBST緩衝液將膜進行洗滌，去除非特異性結合的二抗。




9.訊號檢測：

使用適當的方法（例如，化學發光，熒光等）檢測和視覺化標記的蛋白質帶。如果使用的是熒游標記的二抗，則使用熒光掃描器進行訊號檢測；如果使用的是酶標記的二抗，則新增化學發光底物進行訊號檢測。




這些步驟可以根據具體的實驗需求進行調整，例如，使用不同型別的凝膠，選擇不同的抗體，等等。總的來說，Western Blot是一種強大的技術，可以用來檢測和定量特定蛋白的磷酸化狀態。

百泰派克生物科技--生物製品表徵，多組學生物質譜檢測優質服務商




相關服務：

多通路磷酸化蛋白質組學

磷酸化定量蛋白組學研究

翻譯後修飾蛋白組分析

定量蛋白組分析

靶向蛋白質組學