WB結果分子量增加了20kDa,怎麼去磷酸化、去糖基化來驗證翻譯後的修飾
Western Blot（WB）實驗中，若觀察到某蛋白的分子量相比預期增加了20kDa，這可能表明該蛋白經歷了翻譯後修飾。爲了驗證這一點，你可以採取以下步驟：
一、去磷酸化驗證
1.樣品準備：
首先，確保你有足夠的蛋白樣品。
2.選擇適當的磷酸酶：
通常使用鹼性磷酸酶（如Lambdaprotein phosphatase）或其它專門的去磷酸化酶。
3.進行磷酸酶處理：
根據酶的說明書進行操作，通常是在特定的緩衝液中和酶一起孵育樣品一段時間。
4.再次進行Western Blot：
處理後的樣品再次進行WB分析。如果蛋白的分子量減少，接近其預期大小，這表明蛋白質可能經歷了磷酸化修飾。
二、去糖基化驗證
1.樣品準備：
同樣，確保有足夠的蛋白樣品。
2.選擇去糖基化酶：
常用的去糖基化酶包括PNGase F、O-糖酸酶等，這些酶可以去除N-或O-連結的糖鏈。
3.進行去糖基化處理：
根據酶的說明書進行操作，通常需要在特定緩衝液中孵育樣品和酶。
4.再次進行Western Blot：
處理後的樣品進行WB分析。如果蛋白質分子量減少，接近其理論大小，這可能表明蛋白質經歷了糖基化修飾。
在進行這些實驗時，重要的是要對照實驗組（未處理的樣品）和陰性對照組進行比較，以確保實驗結果的準確性。此外，最佳化實驗條件對於獲得可靠的結果至關重要。
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