怎樣用Western blot檢測目標蛋白質?

Western blot透過將蛋白質樣品經過SDS-PAGE電泳和膜轉移，然後使用特異性抗體進行結合和檢測，可以定量分析目標蛋白質的表達水平。Western blot實驗的大致步驟包括樣品製備、蛋白質定量、電泳分離、膜轉移、抗體結合和檢測等，以下是一些詳細步驟和注意事項：




1.樣品製備：

• 收集細胞或組織樣品，並將其裂解以釋放蛋白質。可以使用細胞裂解緩衝液或RIPA緩衝液等。
• 新增蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑到裂解液中，以防止蛋白質的降解和磷酸化。
• 使用超聲波或離心等方法，使細胞或組織完全裂解，並獲得清晰的裂解液。




2.蛋白質定量：

• 使用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法，對裂解液中的蛋白質進行定量。
• 根據需要，將蛋白質樣品稀釋至相同濃度。




3.SDS-PAGE電泳：

• 將蛋白質樣品加入含有還原劑和SDS的樣品緩衝液中。
• 加熱樣品混合物，使蛋白質變性並解開二級結構。
• 將樣品載入到聚丙烯醯胺凝膠（SDS-PAGE）孔中，並進行電泳分離。
• 根據需要，可以使用不同濃度的凝膠和電泳條件來分離不同大小的蛋白質。




4.蛋白轉移：

• 將分離的蛋白質從凝膠轉移到聚乙烯二醇膜（PVDF）或硝酸纖維素膜（NC）上。
• 使用溼式轉移或半乾式轉移方法，將蛋白質從凝膠中遷移到膜上。
• 確保轉移條件（如電流和時間）適當，以確保蛋白質的完整轉移。




5.阻斷和抗體結合：

• 使用非特異性蛋白質（如牛血清蛋白或BSA）阻斷膜上未被轉移的位點，以減少非特異性結合。
• 將膜孵育在含有目標蛋白質特異性抗體的抗體緩衝液中，以實現抗體與目標蛋白質的特異性結合。
• 孵育時間和溫度應根據抗體和目標蛋白質的特性進行最佳化。




6.二級抗體結合和檢測：

• 使用與目標蛋白質特異性抗體結合的二級抗體，如HRP（辣根過氧化物酶）標記的抗兔IgG或抗鼠IgG。
• 孵育膜與二級抗體，以實現二級抗體與一級抗體的特異性結合。
• 使用化學發光或染色方法，檢測二級抗體與目標蛋白質的結合，並獲得視覺化的結果。




7.資料分析：

• 使用影象分析軟體，如ImageJ或Quantity One，對Western blot影象進行定量分析。
• 透過比較目標蛋白質的帶強度，可以確定其在不同樣品中的表達水平。
• 使用內參蛋白質（如β-actin或GAPDH）作為載入控制，以校正樣品之間的差異。

 

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