怎麼利用層析法純化酶如何確定目的蛋白?
- 將含有目標酶的細胞或組織進行裂解，得到原始的細胞抽提物。
- 通常會用超聲、高壓均質或其他方法裂解細胞。
- 透過離心去除裂解後的細胞碎片和未破碎的細胞。
- 這是一種特異性極高的純化方法，適用於已知與某特定配體結合的酶。
- 將這種配體固定到柱子上，然後透過與目標酶特異性的結合和洗脫來進行純化。例如，對於與某特定底物結合的酶，可以將該底物或其類似物固定到柱子上作為親和配體。
- 在SDS-PAGE上分離目的蛋白後，從凝膠中切取相應的蛋白質條帶。
- 透過酶消化和質譜分析獲得蛋白質的肽段指紋。
- 使用資料庫搜尋軟體，如Mascot、Sequest或MaxQuant等，對肽段指紋進行匹配，確認蛋白質的身份。
一、利用層析法純化酶
層析法基於酶與某種固定相之間的特定相互作用進行分離。以下是利用不同型別的層析法純化酶的基本步驟：
1.製備樣品:
2.初步純化:
使用沉澱法（如硫酸銨沉澱）從細胞抽提物中分離大部分的蛋白質，得到粗酶製劑。
3.凝膠滲透層析 (Gel filtration chromatography):
基於分子大小進行分離。較大的分子首先透過柱子，而較小的分子被凝膠珠子延遲。
4.離子交換層析 (Ion exchange chromatography):
利用蛋白質的表面帶電性進行分離。蛋白質會與柱子上帶有反電荷的固定相結合，然後透過逐漸改變鹽濃度或pH值來洗脫目標酶。
5.親和層析 (Affinity chromatography):
6.水合作用層析 (Hydrophobic interaction chromatography):
基於蛋白質表面的疏水性區域進行分離。首先增加鹽濃度使蛋白質表面的疏水區域暴露出來，然後透過降低鹽濃度來洗脫目標酶。
7.洗脫與濃縮:
從層析柱中洗脫後，根據需要使用超濾或其他方法對酶解進行濃縮。
8.驗證純化效果:
使用SDS-PAGE、活性測定和其他方法驗證酶的純度和活性。
二、確定目的蛋白：
確定目的蛋白通常涉及在一組蛋白或細胞樣品中檢測、定量和驗證特定蛋白質的存在。
1.樣品準備
使用SDS-PAGE將細胞或組織抽提物中的蛋白進行分離。根據預期的目的蛋白分子量觀察是否有相應大小的蛋白質條帶。
2.蛋白鑑定
1）Western Blot:
使用SDS-PAGE分離蛋白後，將其轉移到PVDF或nitrocellulose膜上。使用針對目的蛋白的特異性抗體進行檢測。如果目的蛋白存在，則會觀察到相應大小的條帶。
2）免疫沉澱或親和純化:
如果有針對目的蛋白的特異性抗體或已知其結合夥伴，可以使用免疫沉澱或親和純化來從細胞或組織樣品中提取目的蛋白。
3）免疫細胞化學或免疫熒光染色:
在細胞或組織切片上使用特異性抗體來直接檢測目的蛋白的存在和定位。
4）蛋白質質譜分析:
3.功能性驗證:
對目的蛋白進行功能性實驗，例如酶活性測定、結合測定或生物活性測定，以進一步驗證蛋白質的身份。
確定目的蛋白時，最好使用多種方法並結合多個實驗資料來驗證蛋白質的存在和純度，以確保結果的準確性和可靠性。
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