真核過表達目的蛋白WB檢測不到如何解決？
當在真核系統中過表達目的蛋白，但在Western Blot (WB) 檢測中檢測不到該蛋白時，可能有許多原因。以下是一些建議和策略，幫助您診斷和解決這一問題：
一、檢測方法問題：
1.確保WB實驗操作步驟正確，包括蛋白樣品的製備、電泳分離、轉膜和抗體探針的使用等。
2.檢查蛋白樣品的濃度是否適當，過低的濃度可能導致目的蛋白無法被檢測到。
3.檢查電泳分離和轉膜的效果，確保蛋白樣品已經成功轉移到膜上。
4.檢查抗體探針的選擇和使用方法是否正確，可能需要嘗試不同的抗體或最佳化抗體的濃度和孵育時間。
二、目的蛋白表達問題：
1.檢查目的蛋白的表達水平是否足夠高，可能需要最佳化轉染條件、增加表達時間或使用更高效的表達系統。
2.檢查目的蛋白的穩定性，如果目的蛋白容易被降解或快速轉運到其他細胞區域，可能需要使用蛋白穩定劑或抑制蛋白降解的藥物。
3.考慮目的蛋白的亞細胞定位，如果目的蛋白主要存在於細胞核或細胞質中，可能需要使用不同的細胞裂解方法來提取蛋白。
三、抗體問題：
檢查使用的抗體是否能夠特異性地識別目的蛋白，可能需要驗證抗體的特異性和親和力。
考慮更換抗體，嘗試使用其他來源或克隆的抗體。
考慮使用多個抗體進行驗證，例如使用不同的抗體來檢測同一蛋白的不同區域。
四、轉染/轉化效率：
1.如果使用的是哺乳動物細胞過表達系統，確保轉染效率足夠高。
2.如果使用酵母或其他微生物系統，確保選擇正確的轉化方法和宿主。
五、蛋白修飾和定位：
1.某些蛋白在過表達後可能會進行不同的翻譯後修飾，可能會影響其遷移速率，導致預期的蛋白大小與實際的大小不符。
2.如果目的蛋白主要位於細胞的某一特定部位（例如細胞核），確保您的蛋白提取方法可以有效地從這些位置提取蛋白。
六、其他問題：
1.檢查實驗條件是否適當，例如溫度、pH值等。
2.考慮使用其他檢測方法來驗證目的蛋白的表達，例如免疫組化或熒光染色等。
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