磷酸化蛋白質組學方法

蛋白質組是對生物體中所有蛋白質的序列鑑定和含量分析，但翻譯後修飾（PTM）的資訊也不容忽視。磷酸化蛋白質約佔生物體所有蛋白質的1/3，因此磷酸化已成為最受關注的蛋白質PTM型別之一。

磷酸化蛋白的常用鑑定方法

Western-blot

原理：SDS-PAGE凝膠電泳分離的蛋白質從PAGE凝膠轉移到固相載體上，以一抗為探針，與標記的二抗結合，然後用顯色劑顯色。根據抗原抗體結合的特異性，只有磷酸化的蛋白纔會在相應的分子量處出現一條帶。

優點：特異性強，解析度高，但只能半定量，現在多用於驗證質譜結果。

缺點：難以識別新的位點，難以檢測蛋白質的多個磷酸化位點，因為難以製備特異性磷酸化抗體。

同位素標記法

原理：以放射性同位素³²P標記的磷酸鹽為磷酸基團供體，將³²P標記的磷酸鹽基團在激酶催化下轉移到底物蛋白上，然後進行凝膠電泳分離，並用放射性自顯影法檢測磷酸化蛋白。

優點：可檢測蛋白磷酸化位點和單個蛋白磷酸化。

缺點：放射性強，危險。

質譜法

原理：質譜儀可以將被分析的樣品電離成帶電離子。這些離子在電場或磁場的作用下在空間或時間上分離。檢測後，得到質荷比（m/z）和質譜的相對強度。爲了計算分析物中分子的質量，可以利用質譜圖對被分析物質進行定性分析，並根據離子強度進行定量分析。由於磷酸化多肽的分子量會增加79.9663 Da，因此可以從其他碎片離子訊號中推斷出序列水平的磷酸化修飾位點。

優點：高通量，可同時獲得數千種蛋白質的定性和定量資訊，可測定同一蛋白質的多個磷酸化修飾位點和水平。

缺點：技術難度高，需依賴專業的平臺並具有豐富的質譜知識。

磷酸化蛋白質鑑定方法

磷酸化蛋白質“自下而上”質譜工作流程：

由於蛋白質磷酸化是一個動態過程，細胞內低水平的低丰度磷酸化蛋白質不容易檢測到，高水平的磷酸化肽不僅抑制磷酸化肽電離，還會掩蓋磷酸化肽訊號。因此，在進行質譜分析之前，有效富集純化的磷酸化蛋白變得至關重要。

磷酸化蛋白富集法

考慮到富集能力和成本，應用最廣泛的包括固定化金屬離子親和層析（IMAC）和二氧化鈦親和層析（TiO₂）法。

IMAC原理：IMAC主要由三部分組成：金屬離子、螯合劑和基質載體。在酸性條件下，固定相上的螯合劑與金屬離子形成配位化合物，將金屬離子固定在其上。帶正電荷的金屬離子與帶負電荷的磷酸基結合，吸附磷酸化的肽段。

TiO₂原理：在金屬氧化物親和層析(MOAC)中，TiO₂是一種富集能力很強的金屬氧化物。雖然TiO₂親和層析和IMAC親和層新都是基於金屬離子與磷酸化多肽之間的靜電相互作用來純化和富集磷酸化蛋白。但由於TiO₂親和層析金屬原子與氧原子的相互作用力強，且較穩定，金屬原子不易失去，因此得到廣泛應用。

磷酸化蛋白定量方法

富集的磷酸化肽透過色譜法分離，並可透過質譜法檢測。常用的質譜定量方法包括TMT、LFQ和DIA。

TMT定量

TMT是一種加入同位素標記的定量技術，可以同時對16個樣品進行高精度標記和分析。除了鑑定整個蛋白質組外，TMT還可以用於磷酸化蛋白（PP）的研究。但是，每種標記試劑最多可標記100ug的肽。爲了達到理想的富集效率，一般建議蛋白磷酸化修飾富集的起始量不低於1mg，如果採用TMT標記定量方法，建議樣本數至少為10 。因此，TMT標記定量方法對樣本量要求高，成本較高，而非標記定量更適合大規模檢測。

FLQ

與TMT標記定量相比，非標記定量操作更簡單，樣品損失更少，一次實驗可以定量更多的蛋白質，但嚴重依賴質譜儀的穩定性。傳統的無標記定量方法是LFQ（Label-free），它依賴於DDA的資料採集方式，而磷酸肽異構體很難用DDA進行取樣和分配。對大量樣本中的磷酸化位點進行系統且可重複的分析具有挑戰性。

DIA

DIA採集模式可以用於分析磷酸肽嗎？

由於DIA資料採集視窗更寬，光譜更復雜，因此在混合光譜中正確定位磷酸化位點並正確分析磷酸肽異構體的能力需要更高水平的光譜處理。

2020年2月，來自丹麥的研究團隊突破了這一技術難關，在《Nature Communications》上發表文章，提出了DIA和direct DIA（沒有DDA文庫構建的DIA）鑑定磷酸化蛋白的完整工作流程。研究團隊透過TiO₂富集野生型酵母細胞中的磷酸化肽，然後分別透過DDA和DIA和dDIA對其進行量化。發現最佳化的DIA方法可量化多達DDA兩倍的磷酸化肽，並且dDIA比DDA鑑定的重現性更好。將酵母磷酸肽與HeLa細胞磷酸肽樣品按不同比例混合，然後分別進行定量。結果表明，DIA和dDIA定量的肽段也隨著濃度的增加成比例增加，準確度更好。DIA 和 DDA 的錯誤率相當，但 DIA 在位點覆蓋、靈敏度和動態範圍方面優於 DDA。

總結

如果預算充足，樣本量小，可以使用TMT檢測磷酸化蛋白，否則推薦使用DIA方法，尤其是在樣本量大的情況下，DIA在重現性和準確性上優於LFQ。

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