BTP專案文章 | 利用蛋白質組學技術從頭測序、蛋白鑑定研究新型抗NSCLC蛋白PFAP
非小細胞肺癌（NSCLC）是最常見的肺癌型別，約佔肺癌病例的85%。同時，有超過30%的NSCLC患者被診斷為晚期。然而，儘管目前存在放化療技術和新的輔助免疫治療，但對於提高晚期NSCLC患者的生存率仍未達到理想效果，放化療後的5年生存率仍然維持在10-15%之間。
與傳統藥物不同，蘑菇因其免疫調節、抗炎和抗腫瘤的特性備受矚目。蘑菇不僅可以直接抑制癌細胞，還可以作為輔助治療的選擇，有助於改善因癌症引起的噁心、嘔吐、腹瀉、疲勞和失眠等症狀，並增強人體免疫系統功能。因此，基於蘑菇中的抗癌活性化合物，開發新的針對NSCLC的藥物具有極大的前景和潛力。
2023年7月，南開大學和香港中文大學的科研團隊在International Journal of Biological Macromolecules雜誌（IF=8.025）上發表了題為“New fungal protein from Pleurotus ferulae lanzi induces AMPK-mediated autophagy and G1-phase cell cycle arrest in A549 lung cancer cells”《阿魏蘑菇中的新型蛋白PFAP透過AMPK調節的自噬和G1期細胞週期阻滯誘導A549肺癌細胞》的研究成果。該研究從阿魏蘑菇（Pleurotus ferulae lanzi）中分離出一種新型的抗非小細胞肺癌（NSCLC）蛋白PFAP，並採用蛋白質組學技術對其進行了鑑定和抗腫瘤機制研究。透過從頭測序的分析結果顯示，PFAP是由135個氨基酸殘基構成的蛋白質，其理論分子量為14.81 kDa。透過串聯質譜標記（TMT）™定量蛋白質組學分析，研究表明PFAP能夠透過調節AMPK / mTOR途徑並抑制A549肺癌細胞的G1期細胞週期來誘導自噬作用。此外，研究還發現PFAP可以抑制體內異種移植腫瘤在裸鼠中的生長。由於PFAP對於NSCLC表現出高抗性和低毒性，因此有望作為一種潛在的抗NSCLC新藥。這項研究為開發治療NSCLC的新策略提供了堅實的理論基礎。此研究中使用的多種蛋白質組學技術，從頭測序、液相色譜-串聯質譜法蛋白質鑑定和串聯質譜標記（TMT）™定量蛋白質組學分析，均由百泰派克生物科技（BTP）提供。
主要研究內容及結果
1：新型抗腫瘤蛋白PFAP的純化與鑑定
透過對蘑菇子實體的粗蛋白提取物進行疏水交換色譜分離，得到了OF1、OF2（未吸附）和OF3（吸附）三個餾分，見圖1a。從SDS-PAGE條帶中收集並濃縮了OF3的一部分，而OF1和OF2則沒有出現條帶（圖1b）。隨後，採用凝膠過濾色譜柱對OF3的餾分進行純化，得到了分子量為14.68 kDa的單一峰（圖1c，圖1d），並將這個純化的蛋白質命名為PFAP。透過LC-MS/MS進行從頭測序發現，PFAP是一個由135個氨基酸殘基組成的蛋白質。
圖1. PFAP的純化和鑑定
2：PFAP對體外A549細胞的誘導死亡作用
爲了評估PFAP對A549細胞活力的影響，我們將細胞與不同濃度（0、50、100、150和200μg/mL）的PFAP在不同時間點（12、24和48小時）內共同孵育。結果顯示，隨著PFAP濃度和孵育時間的增加，A549細胞逐漸空泡，暴露於PFAP 48 h後的細胞生長抑制率最高，表明PFAP是一種高效、低毒性的抗腫瘤蛋白。
圖2. A549細胞的形態學特徵和PFAP的細胞毒性
a：倒置熒光顯微鏡下觀察到的A549細胞受PFAP影響的影象（放大倍數：10×10）；b：對A549細胞使用不同濃度的PFAP進行不同持續時間（12、24和48小時）處理，並透過SRB測定評估細胞毒性；c：對HEK293細胞使用不同濃度的PFAP處理48小時，並透過SRB測定評估細胞毒性。
3：基於TMT™的蛋白質組學分析揭示的PFAP對A549細胞的影響
爲了更深入瞭解PFAP的作用機制，我們採用了基於TMT™的定量蛋白質組學分析，對A549細胞中的蛋白質變化進行了分析。我們採用了|log2FC|≥0.263，p<0.05作為差異表達蛋白的標準。共有226種差異表達的蛋白質被鑑定出來，其中115種上調錶達，111種下調錶達（圖3b）。
圖3. 蛋白質組學分析
a：電泳圖；b：差異蛋白質火山圖；c：功能註釋分析；d：KEGG富集分析。
4：PFAP在體內抑制肺腺癌細胞的生長
爲了探究PFAP在體內的抗腫瘤機制，我們將PFAP腹膜內注射到皮下接種A549細胞的裸鼠中。在進行了七次注射後，與陰性對照組相比，PFAP治療組的腫瘤重量和體積在第15天顯著降低（圖4a-c）。
圖4. PFAP對體內非小細胞肺腺癌的抑制作用
a: PFAP抑制攜帶A549細胞異種移植物的小鼠實體瘤生長。每組包含五隻小鼠。b：PFAP對實體瘤重量的影響；c：PFAP對實體瘤體積的影響；d：透過HE染色觀察到的腫瘤組織；e：異種移植腫瘤中Ki67的IHC和積分光密度的統計。**p < 0.01。f : PFAP對體重的影響。
綜上所述，本研究透過從頭測序技術鑑定了一種新型的抗腫瘤蛋白PFAP，並透過基於TMT™的定量蛋白質組學分析揭示了PFAP對A549細胞的影響。PFAP在體外抑制肺癌A549細胞的生長，在體內也顯示出抑制異種移植腫瘤的潛力。由於PFAP對非小細胞肺癌表現出高抗性和低毒性，因此在抗癌治療方面有著良好的前景。
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