BTP專案文章 | 驢和人初乳以及成熟乳中的乳脂球膜蛋白質的特定位點N-糖基化表徵和比較
2023年5月，瀋陽市北方戰區總醫院和瀋陽農業大學合作在食品科技一區Top期刊Food Chemistry（IF=8.8）上發表了題為”Characterization and comparison site-specific N-glycosylation profiling of mature milk fat globule membrane proteome in donkey and human colostrum and milk”的研究論文。本研究旨在透過位點特異性糖蛋白質組學研究策略，系統表徵驢乳和人乳乳脂球膜（MFGM）糖蛋白的位點特異性N-糖基化表達圖譜。結果發現驢初乳（DC）、驢成熟乳（DM）、人初乳（HC）和人成熟乳（HM）中存在大量的位點特異性N-糖鏈，揭示了驢乳和人乳MFGM N-糖蛋白的組成差異以及在泌乳期間驢乳和人乳MFGM糖蛋白位點特異性N-糖基化的動態變化。
研究背景
母乳對於新生兒的頭六個月或更長時間的健康飲食至關重要。然而，全球僅有36%的嬰兒在六個月內完全由母乳餵養，國內更低，僅有21%，從而導致嬰兒配方奶粉市場蓬勃發展。市面上常見的以牛乳為基礎的奶粉存在牛乳蛋白過敏、消化不良和易患腸道炎症等風險，因此，開發其他奶源的嬰兒配方奶粉以縮小與母乳在營養成分方面的差距非常重要。
驢乳在生化成分和感官特性上與人乳相似，且富含生物活性和抗感染因子，能夠支援新生兒的健康代謝和正常生理功能。因此，驢乳被認為是可以直接取代嬰兒配方奶粉中蛋白質來源的理想選擇。此外，相較於人乳，驢乳的乳脂球（MFG）更小，小尺寸的乳脂球有助於更多的乳脂球膜（MFGM）被吸收。在哺乳過程中，含有三醯甘油核心的MFG透過分泌從乳腺上皮的頂端釋放，並被頂端質膜所包裹。MFGM不僅穩定了MFG結構，還在改善新生兒的腸道構造、腸道黏膜屏障和神經認知發育方面發揮著重要作用。MFGM蛋白佔乳蛋白總量的1% - 4%，對新生兒的各種細胞過程和免疫防禦機制具有重要作用。驢MFGM蛋白含有947種蛋白，參與了先天免疫反應、細胞凋亡和細胞間粘附等生物過程。
作為膜蛋白，MFGM蛋白的表面具有豐富的糖基化修飾。其中，N-糖基化是最豐富且最常見的翻譯後修飾，不僅調控蛋白質摺疊系統以改善蛋白質的生物物理性質，還能增強蛋白質底物的生物活性，如益生元、免疫調節和抗病原性等。近年來，位點特異性糖蛋白組學技術的迅猛發展已成為研究糖蛋白中肽段序列以及與之相連的糖鏈結構的主要策略。
在本研究中，位點特異性糖蛋白組學分析、N-糖基化的全域性分析、N-糖蛋白的GO功能註釋分析、糖蛋白核心與分支結構比較、N-糖蛋白的鑑定，均由百泰派克生物科技提供服務。百泰派克生物科技開發了一系列穩定高效的液相色譜高分辨質譜 (LC-MS/MS)表徵方法，涵蓋了從糖鏈分析，到糖基化位點鑑定（N糖基化位點和O糖基化位點分析），再到糖肽解析到完整分析流程。
主要研究內容及結果
本研究主要採用位點特異性糖蛋白組學技術，對驢初乳（DC）、驢成熟乳（DM）、人初乳（HC）以及人成熟乳（HM）的乳脂球膜蛋白（MFGM）進行了位點特異性N-糖基化圖譜的繪製。研究揭示了這四種MFGM蛋白在總體和微觀層面的差異，透過生物資訊學分析，進一步探究了DC、DM、HC和HM的MFGM蛋白N-糖核心以及分支結構之間的關係，以及這些結構對多種生物過程的影響。這項研究將有助於更深入地理解驢和人乳MFGM蛋白的糖基化結構和功能，為未來的研究提供了更深入的方向。
1.驢和人乳MFGM蛋白的位點特異性糖蛋白質組學分析
圖1 DC、DM、HC和HM MFGM蛋白的位點特異性糖蛋白質組學分析
圖中呈現了透過位點特異性糖蛋白質組學研究方法，對DC、DM、HC和HM樣本的N-糖蛋白、N-糖基化位點以及N-糖鏈分佈進行系統性的表徵。同時，圖中還包括了四種樣本中共有和獨有的糖蛋白與N-糖鏈的分析結果。研究資料顯示，在初乳（DC、HC）中相較於成熟乳（DM、HM），能夠鑑定出更多的N-糖蛋白以及位點特異性N-糖鏈。這可能有助於與病原微生物及其毒素競爭性地與新生哺乳動物腸上皮細胞表面的聚糖受體結合，從而避免腸道感染。
2.哺乳期間驢和人乳MFGM糖蛋白N-糖基化修飾的全域性分析
圖2 驢和人乳中MFGM N-糖蛋白的N-糖位點以及位點特異性N-聚糖分析
圖2A展示了各樣本中N-糖蛋白數量隨著糖蛋白上N-糖基化位點數量的增加而減少的宏觀異質性。圖2B體現了樣本中隨著N-糖基化位點攜帶N-糖鏈的數量增加，對應N-糖基化位點數量先減少後增加的趨勢。研究也觀測到一些位點攜帶大量位點特異性的N-糖鏈，如在驢乳MFGM糖蛋白中，來自DC的乳轉鐵蛋白N502位點攜帶58種N-糖鏈；在人乳MFGM糖蛋白中，來自HC的乳粘蛋白N238位點攜帶了137種N-糖鏈。圖2C根據糖鏈組成對N-糖鏈種類進行了分類，並統計了不同種類N-糖鏈的丰度情況。其中值得注意的是，人和驢乳MFGM糖蛋白上均存在大量的唾液酸或巖藻糖修飾，唾液酸與巖藻糖基化對新生哺乳動物的視網膜發育、腸道菌群形成、免疫系統改善、大腦發育和認知功能等過程具有極為積極的生物作用，本研究也揭示了這兩種糖基化型別在乳汁中高表達的重要性。N-糖鏈根據核心巖藻糖與平分型乙醯葡萄糖胺的存在與否可以分類為四種核心結構，圖2D展示了各樣本中鑑定到的N-糖鏈的核心結構分佈。人乳MFGM糖蛋白HC與HM的N-糖鏈的核心結構分佈較為接近，並且相較於驢乳擁有更高的核心巖藻糖修飾。在驢乳MFGM糖蛋白中DM的核心巖藻糖修飾水平相較於DC則更低。N-糖鏈結構的豐富性與複雜性也表現在分支結構的型別。圖2E對樣本中鑑定到糖鏈的所有分支結構進行了彙總與比較，資料顯示人與驢乳MFGM糖蛋白主要分支結構包括甘露糖、LacNAc、GlcNAc、Lewis與末端唾液酸等分支型別。該資料還直觀地展示了樣本中所有分支型別的佔比以及不同樣本中分支型別的丰度差異。
3.驢和人乳中MFGM N-糖蛋白的GO功能註釋分析
圖3. DC（A）、DM（B）、HC（C）和HM（D）中MFGM N-糖蛋白的GO分析
對所有鑑定出的蛋白進行GO功能註釋分析後發現，DC、DM、HC和HM MFGM糖蛋白主要參與細胞粘附，且其主要定位於內質網、細胞表面、細胞外空間以及質膜。另外，DC、HC和HM的MFGM糖蛋白與整合素和肌動蛋白結合；而DC、DM和HM的MFGM糖蛋白具有肝素結合特性。此外，DC、DM和HC的MFGM糖蛋白也具有鈣結合特性。不僅如此，DC、DM、HC和HM的MFGM糖蛋白在吞噬體、補體和凝血級聯通路中都有參與，其中吞噬體在DC、DM、HC和HM MFGM糖蛋白相關的KEGG通路中排名第三。吞噬作用是一種先天防禦機制，吞噬細胞和中性粒細胞等細胞吞噬和追捕各種病原體，以應對病原體感染。因此，大量富集在吞噬體中的MFGM糖蛋白表明了它們在新生哺乳動物的生理過程中具有重要作用。
4.驢和人初乳中特異性MFGM糖蛋白核心與分支結構比較
圖4. 與不同生物過程相關的DC和HC特異性MFGM糖蛋白核心與分支結構比較
接下來，研究人員根據BP分析的結果，對涉及不同生物過程的人和驢初乳MFGM糖蛋白的核心結構與分支結構進行了對比。研究發現，這些糖蛋白在人和驢初乳中表現出不同的特異性表達，並參與了不同的生物學過程。如圖4所示，在DC特異性MFGM糖蛋白中，具有五糖核心、甘露糖分支和GlcNAc分支結構的蛋白主要參與細胞粘附、整合素介導的訊號通路以及靶向溶酶體的過程。而HC中的Lewis分支結構主要在抗原加工和呈遞等生物過程中表達，同時唾液酸化的LacNAc在抗原加工和呈遞相關的過程中也顯示出高水平的表達。這些結果表明，MFGM糖蛋白在不同生物過程中具有不同的核心和分支結構，並且在理解和調控乳中糖蛋白功能方面具有重要意義。
5.初乳與成熟乳中特異性MFGM糖蛋白核心與分支結構比較
圖5. 與不同生物過程相關的DC和DM特異性MFGM糖蛋白核心與分支結構比較
緊接著，研究人員進一步對人和驢初乳以及成熟乳中涉及不同生物過程的MFGM糖蛋白的核心與分支結構進行了比較。圖5呈現的結果顯示，在驢乳中，DC特異性的MFGM糖蛋白具有五糖核心和甘露糖分支結構的蛋白主要參與細胞粘附、溶酶體靶向蛋白、溶酶體組織和整合素介導的訊號通路等生物過程。DM特異性的糖蛋白中，具有五糖核心和帶有或不帶有唾液酸化的LacNAc分支結構的蛋白主要涉及嘧啶核苷轉運、嘌呤核苷跨膜轉運和核苷跨膜轉運等生物過程。在人乳中，HC特異性MFGM糖蛋白具有五糖核心結構，同時還包含甘露糖和LacNAc分支結構的蛋白主要在病毒進入宿主細胞、血管生成正調節和蛋白激酶B訊號正調節等通路中發揮作用。而在人成熟乳（HM）中，特異性MFGM糖蛋白具有五糖核心結構，並伴隨著甘露糖、Lewis和GlcNAc分支結構的蛋白，主要參與蛋白質分泌、蛋白質轉運、低密度脂蛋白顆粒清除以及膽固醇穩態的正向調節等生物過程。
6.驢和人乳中共有的MFGM N-糖蛋白表徵
圖6. DC、DM、HC、HM共有的MFGM N-糖蛋白表徵
在此研究中，藉助完整糖肽為基礎的糖蛋白質組學技術，對泌乳期驢乳和人乳中的MFGM糖蛋白進行了全面研究。研究團隊鑑定了12種在DC、DM、HC和HM中共同存在的MFGM糖蛋白，其中包括親丁基蛋白亞家族1成員A1、白細胞表面抗原CD47、血小板糖蛋白4、乳轉鐵蛋白、黏蛋白4等。功能分析表明，在驢乳中共有的MFGM糖蛋白主要參與細胞增殖的正調控和基因表達的負調控等生物過程；而在人乳中共有的MFGM糖蛋白則主要富集於天然免疫應答、細胞增殖的正調控以及細胞凋亡過程的負調控等生物過程中。KEGG通路分析顯示，驢和人乳中共有的MFGM糖蛋白與AMPK訊號通路和ECM-受體相互作用通路相關。
對於糖鏈結構的修飾，研究發現核心結構存在與否主要與核心巖藻糖的存在相關。相較於驢乳，人乳中核心巖藻糖修飾水平更高，尤其在DM中，大部分核心結構為核心五糖結構。在驢乳中，更常見的是甘露糖和單一GlcNAc分支這類簡單的分支結構，而在人乳中，複雜分支如Lewis類和存在或不存在唾液酸修飾的LacNAc分支則更為豐富。
綜上所述，本研究透過完整糖肽為基礎的糖蛋白質組學技術，全面地研究了泌乳期的驢乳和人乳中的MFGM糖蛋白。研究不僅鑑定了多種N-糖蛋白，還詳細描述了它們的位點特異性N-糖基化譜。透過GO註釋和KEGG通路分析，揭示了不同MFGM糖蛋白的生物活性與N-糖基化之間的關係，為N-糖結構和生物功能提供了重要資訊。此外，研究為糖基化調節人類健康生理學提供了新的視角，併爲進一步開發類似於人乳的驢乳嬰兒配方奶粉提供了技術支援。
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