糖基化分析之糖基化位點分析

蛋白糖基化是一種在生物體內發生的過程，透過糖基轉移酶的作用，糖類化合物與蛋白質上的氨基酸殘基形成糖苷鍵，從而將糖類化合物連線到蛋白質上。這個過程開始於內質網，然後在高爾基體結束。經過糖基化修飾的蛋白質被稱為糖蛋白。

糖基化對生物製品的療效、穩定性和免疫原性有著重要的影響。其中，寡糖譜和糖鏈結構是評估生物製品特性的關鍵指標。作為重要的碳水化合物，寡糖參與蛋白質摺疊和訊號傳導等多種細胞生命過程。此外，它們還經常與蛋白質結合形成糖蛋白。糖蛋白常位於細胞表面，參與細菌和病毒的識別以及凝集素等其他蛋白質的相互作用，對於生物製品的正常功能至關重要。

寡糖是非模板合成的，並具有樹狀結構，這增加了寡糖結構解析的挑戰。為此，百泰派克生物科技BTP開發了一系列穩定、高效的液相色譜高分辨質譜（LC-MS/MS）表徵方法。這些方法涵蓋了從糖鏈分析到糖基化位點鑑定，再到糖肽解析的完整分析流程。透過這些方法，我們能夠有效地研究和解析寡糖的結構和功能特性。糖基化分析基本流程圖如下所示。

圖1 糖基化分析流程圖

一、生物製品N糖基化位點分析

1.原理

透過在重水中使用PNGase F來釋放糖鏈並標記18O的方法，可以實現N-糖基化位點分析。首先，根據蛋白質的理論氨基酸序列資訊，選擇適當的蛋白酶將蛋白質切割成肽段。待溶劑揮發後，我們在重水中進行切糖處理。然後，透過液相色譜-高分辨質譜技術，我們能夠確定帶有18O修飾的N-糖基化位點所在的肽段，從而確定N-糖基化的位置。透過比較修飾和未修飾肽段的質譜峰積分面積，我們還能夠確定該糖基化位點的修飾效率。這些分析方法可以幫助我們深入研究和了解蛋白質的N-糖基化修飾。

2.實驗儀器

• NanoLC: Vanquish NEO

• MS: Orbitrap Fusion Lumos

3.實驗結果展示

圖2 N糖基化位點二級圖

注：圖中N糖基化修飾在肽段第八位氨基酸上，分子量變化為+2.988，橫座標為質荷比，縱座標為訊號強度

二、生物製品O糖基化位點分析

1.原理

我們採用直接分析O糖肽的方法，進行O-糖基化位點分析。首先，根據蛋白質的理論氨基酸序列資訊，選擇適當的蛋白酶將蛋白質切割成肽段。然後，透過液相色譜-高分辨質譜技術採集質譜原始資料。將這些資料匯入O糖資料庫，將O糖修飾作為可變修飾加入到資料分析中。最終，確定蛋白質中哪些位點發生了O糖基化修飾。透過這種分析方法，我們能夠準確地確定O糖基化位點，從而深入研究蛋白質的糖基化修飾特徵。

2.實驗儀器

• NanoLC: Vanquish NEO

• MS: Orbitrap Fusion Lumos With ETD

3.實驗結果展示