生物製品表徵之自由巰基定量
巰基和二硫鍵在生物化學和分子生物學中扮演重要角色，它們常以活性功能基的形式參與酶催化、輔助因子結合以及蛋白質構象的維持。研究巰基的數量和性質是獲取特定結構資訊的重要手段之一。
巰基定量常用的方法之一是利用Ellman法檢測自由巰基濃度。該方法的原理是將DTNB試劑與遊離巰基發生反應，生成2-硝基-5-硫代苯甲酸（TNB-）。在中性或鹼性pH條件下，TNB-可以進一步離子化形成二價陰離子TNB2-。該TNB2-離子呈現黃色，在412nm波長處可見光吸收，因此可以定量測定TNB2-的濃度。透過使用半胱氨酸標準品或基於摩爾吸光係數的方法，可以對自由巰基進行定量分析。
北京百泰派克生物科技BTP基於該方法建立了自由巰基含量檢測平臺，獲得CNAS實驗室認可，可以準確測定樣品中的自由巰基含量，為巰基相關研究提供有力支援。BTP可提供全面的解決方案，包括方法學的建立、驗證以及後續樣品檢測。
一、自由巰基定量的方法及原理：
1. 使用半胱氨酸標準品進行定量
該方法透過將不同濃度的半胱氨酸標準品和待測樣品與DTNB試劑反應，然後測定在412nm處的吸光值。透過使用半胱氨酸標準品的吸光值繪製標準曲線，將待測樣品的吸光值代入標準曲線中，就可以得到自由巰基的濃度。
2. 基於摩爾吸光係數的定量
該方法基於一個基本原理，即新增1摩爾的巰基會釋放1摩爾的TNB。透過測定在412nm處的可見光吸光度，可以定量測定TNB2-的濃度。由於在不同緩衝液中消光係數不同，可以使用以下公式計算樣品中自由巰基的濃度：消光係數 = 吸光度 / （比色皿寬度（cm） * 摩爾濃度（mol/L））。
表1 在不同緩衝液中的消光係數
以上兩種方法都可以準確測定樣品中的自由巰基含量，根據實際需求選擇適合的方法進行分析。
二、實驗儀器
紫外-可見分光光度計
三、應用
自由巰基的含量與某些蛋白質的性質和存在方式密切相關，影響抗體的生物學功能。透過檢測自由巰基的含量，可以在工藝早期對細胞系進行篩選，在蛋白質結構研究中具有重要意義。自由巰基含量的檢測有助於瞭解蛋白質的構象和特性，進而為蛋白質工程和生物製藥等領域的研究和應用提供重要參考。
四、案例示意
如圖為標準曲線，橫座標為吸光度，縱座標為半胱氨酸標準品濃度
五、方法驗證
《中華人民共和國藥典》2020年版三部通則0401/四部通則 0401紫外-可見分光光度計法根據檢測方法驗證表要求：
• 專屬性確認：選用不同濃度（分別為1.50、1.25、1.00、0.75、0.50、0.25 mM）的半胱氨酸標準品，同時製備1.50、1.25、1.00、0.75、0.50、0.25 mM六種濃度供試品（不含半胱氨酸的多肽溶液），判斷無關基團對檢測是否有影響。
• 重複性確認：在1.0 mg/mL的供試品中分別加入終濃度為1.00 、0.75、0.50 mM的半胱氨酸標準品，每個濃度做六個重複，分別記錄其吸光度，計算RSD。
• 線性確認：選用不同濃度（分別為1.50、1.25、1.00、0.75、0.50、0.25、0.00 mM）的半胱氨酸標準品溶液，進行五次重複性的實驗，以半胱氨酸濃度Y對吸光值X作圖來繪製標準曲線，計算最佳線性範圍內的相關係數R2。
• 準確度確認：以1.0 mg/mL的供試品作為空白對照，對1.0 mg/mL的供試品分別製備0.5、0.75、1.0 mM三個濃度的加樣回收樣品進行回收率測定。
• 範圍確認：將0.25 mM和1.5 mM 半胱氨酸作為待測樣品進行檢測，分別平行檢測11次，計算變異係數（CV）。
常見問題
問題1：影響Ellman法測定自由巰基的因素有哪些？
回答：
1. EDTA用量：適量加入EDTA有助於穩定TNB的顯色產物，以及確保測定結果與半胱氨酸的濃度成梯度線性關係。
2. 緩衝液：不同緩衝液對TNB的最大吸收波長略有差異，因此需根據所選緩衝液來確定合適的測定條件。
3. pH值：DTNB的降解速度隨著pH的升高而加快，因此需在適當的pH範圍內進行測定。
4. 溫度：摩爾吸光係數在不同溫度下有所變化，隨著溫度的升高，摩爾吸光係數可能會下降。
問題2：Ellman法測定自由巰基的優勢是什麼？
回答：Ellman法具有高靈敏度、操作簡便、耗時短等優勢。透過測定412nm處的吸光度，可以快速、準確地定量自由巰基的含量。此方法廣泛應用於巰基含量的檢測，並且在生物化學、分子生物學等領域中被廣泛使用。
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