生物製品表徵之二硫鍵分析
二硫鍵是一種相對穩定的共價鍵，在蛋白質分子中扮演著重要角色，穩定了肽鏈的空間結構，對於生物活性和功能起著決定性作用。二硫鍵廣泛存在於細胞表面受體、抗體、生長因子、激素、酶等蛋白質中，並且容易被還原或發生錯誤配對，導致原始多肽或蛋白質的結構和生物學活性受到影響。因此，分析多肽或蛋白質中二硫鍵對於理解和解釋其高階結構和生物學功能具有重要意義，在蛋白和多肽類生物製品的研發過程中至關重要。
質譜法是一種高靈敏度的二硫鍵分析方法。該方法利用質譜儀對生物分子進行分析，可以直接檢測二硫鍵的存在和數量。百泰派克生物科技BTP基於液質聯用高分辨質譜儀建立多肽/蛋白二硫鍵檢測的平臺，並透過CNAS實驗室認可，可以對蛋白質和多肽類生物製品中的二硫鍵配對情況進行定位和相對定量分析，為研發過程提供了重要的技術支援。
質譜法分析二硫鍵的原理
質譜法分析二硫鍵的原理與傳統蛋白質分析方法有所不同。在二硫鍵鑑定中，不進行還原處理，而是直接進行烷基化，這個步驟將遊離的巰基封閉。隨後，進行酶切操作，將蛋白質分子切割成小片段。在這個過程中，存在二硫鍵的半胱氨酸之間形成了特定的連線，導致分子量發生變化。接下來，透過質譜儀採集資料，並使用相應的分析軟體進行資料庫匹配，從而得到二硫鍵的資訊。質譜法進行二硫鍵分析可以準確地鑑定蛋白質中二硫鍵的位置和數量，為生物製品研發和質量控制提供重要的資訊。
實驗儀器
• 高效液相色譜儀：Easy-nLC 1200 （Thermo Fisher Scientific）
• 高分辨質譜儀：Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer（Thermo Fisher Scientific）
應用
質譜法在二硫鍵分析中的應用具有廣泛的價值。透過質譜法進行二硫鍵的定性和相對含量分析，可以提供蛋白質二硫鍵的準確定位資訊，同時還可以獲得二硫鍵配對的半胱氨酸修飾比例資訊。這些資訊對於研究蛋白質和多肽的生物活性和功能具有重要幫助。此外，質譜法還可以用於評價標準品與實際產品之間的一致性以及不同批次之間的穩定性。
透過質譜法的定性分析，我們可以確定樣品中存在的二硫鍵的具體位置，從而深入理解蛋白質的結構和功能特徵。這對於藥物開發、蛋白質工程和蛋白質相互作用研究等領域具有重要意義。同時，相對定量分析可以提供二硫鍵配對的半胱氨酸修飾比例資訊，有助於評估樣品中二硫鍵的相對丰度和變化趨勢。這對於檢測樣品的一致性、穩定性以及質量控制具有重要作用。
案例示意
表1 二硫鍵分析
Site：形成二硫鍵的半胱氨酸在蛋白中的位置；Enzyme：酶解蛋白所用的酶；Peptide：肽段序列；Peptide_Mass：肽段分子量；Mass_Error(ppm)：肽段的質量偏差
圖1 肽段二級圖
常見問題
問題1：質譜法鑑定二硫鍵的優勢是什麼？
回答：質譜法在鑑定二硫鍵方面具有多個優勢。首先，它不僅可以確定二硫鍵的存在與數量，還能確定二硫鍵的具體位置和相對含量，提供了更詳細的資訊。其次，質譜法具有高靈敏度和高解析度的特點，可以準確地檢測和定量二硫鍵，即使在低濃度下也能獲得可靠的結果。此外，質譜法所需的樣品消耗量相對較少，對於寶貴或有限的樣品而言具有重要意義。因此，質譜法在二硫鍵分析中被廣泛應用，為研究蛋白質結構和功能提供了有力的支援。
問題2：為什麼要進行烷基化？
回答：進行烷基化是爲了封閉遊離巰基，防止實驗過程中二硫鍵發生錯配。在質譜分析中，樣品的製備過程需要進行特殊處理，其中包括烷基化步驟。烷基化是透過將烷基化試劑與巰基反應，使巰基被烷基取代，形成烷基硫醇。這樣可以有效地阻止巰基之間的反應，避免在實驗過程中形成不正常的二硫鍵連線或錯配。透過烷基化處理，可以確保在質譜分析中得到準確而可靠的二硫鍵資訊，有助於揭示蛋白質的結構和功能特徵。
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