寡核苷酸分析
寡核苷酸，包括脫氧核糖核酸 (DNA) 和核糖核酸 (RNA)，越來越多地用於診斷和治療。例如，可以將DNA引入免疫細胞中，對它們進行基因改造，使其表達嵌合抗原受體蛋白，用於基於細胞的免疫治療。各種 RNA ，包括信使 RNA (mRNA) 和小干擾 RNA (siRNA)，也分別用於蛋白質瞬時表達和干擾蛋白質表達，以用於治療應用。隨著寡核苷酸使用的增加，採用有效的方法來純化、分析和表徵寡核苷酸變得越來越重要。
寡核苷酸分析流程
一、寡核苷酸純化方法
1.聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE) ：
SDS-PAGE是一種標準的純度分析方法，可用於根據寡核苷酸的大小分離寡核苷酸。聚丙烯醯胺凝膠首先透過丙烯醯胺在交聯劑存在下聚合形成，形成網狀凝膠網路。然後施加電場，導致帶負電的寡核苷酸向正極移動。根據寡核苷酸的大小，較小的分子比較大的分子更容易、更快速地穿過凝膠網路。經過設定的時間後，不同大小的寡核苷酸將在聚丙烯醯胺凝膠中遷移不同的距離，從而可以根據大小提取和純化它們。
2.離子對反相高效能色譜 (IP-RP-HPLC) ：
IP-RP-HPLC是最流行的寡核苷酸純化技術，在此技術中，新增低濃度的長鏈烷基胺，使其與 LC 流動相中的帶負電荷的寡核苷酸結合。寡核苷酸在LC柱中的保留和洗脫受到寡核苷酸的電荷和離子對試劑（例如乙酸三乙銨）中的烷基鏈長度等因素的影響。例如，保留時間通常與離子配對試劑中寡核苷酸的電荷和長烷基鏈的疏水性成比例增加。IP-RP-HPLC 的一個關鍵優勢是它還可以直接與質譜儀耦合，以對寡核苷酸進行詳細的質量表徵。
圖1.離子對反相高效液相色譜（IP RP HPLC）寡核苷酸純度分析
二、寡核苷酸的質量表徵
分析寡核苷酸純度的一種方法是使用質譜 (MS) 分析其質量。常見的方法之一是基質輔助鐳射解吸/電離飛行時間 (MALDI TOF) MS。該技術使用具有化學基質的鐳射來電離寡核苷酸樣品，然後將離子加速透過飛行管到達檢測器，檢測器測量作為時間函式的粒子計數。 TOF 與分子的質量成正比。 MALDI TOF MS 具有高通量，非常適合分析 50 個鹼基以下的寡核苷酸，因為電離效率和分離解析度會降低。還存在光敏修飾寡核苷酸可能被強鐳射源損壞的風險。
三、寡核苷酸的結構表徵
1.X射線晶體學
解析寡核苷酸結構的最有力方法是使用X射線晶體學，這與許多諾貝爾獎間接相關。X射線的波長與分子中原子間鍵的尺寸相同， 約為1.5埃，可以提供高度詳細的寡核苷酸結構。透過分析散射X射線，可以確定樣品中的電子密度分佈，從而重建內部分子排列。
2.核磁共振 (NMR)
表徵寡核苷酸結構的另一種流行方法是核磁共振 (NMR)。 NMR 相對於 X 射線晶體學的優點是分子不必結晶。當處於強恆定磁場中的原子核受到弱振盪磁場的擾動時，它會透過發射具有原子核磁場頻率特性的電磁訊號來做出響應。當外部場的振盪頻率與原子核的固有頻率相匹配時，這種情況就會發生在共振頻率處。因此，核磁共振譜提供了源自樣品中不同原子核的特定共振特性的結構資訊。根據實驗的具體目標（例如解析度），使用不同的 NMR 設定。
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