如何檢測蛋白泛素化——IP
蛋白泛素化（Protein Ubiquitination）是一種重要的細胞生物學過程，它涉及到泛素蛋白（Ubiquitin）與目標蛋白結合，從而調控目標蛋白的降解、定位、啟用等功能。爲了檢測蛋白泛素化，通常可以採用免疫共沉澱（Immunoprecipitation，IP）結合Western blot、質譜分析等方法。以下是一個常見的蛋白泛素化IP的步驟：
圖1.泛素化修飾研究路線
1、細胞或組織的提取：
收集細胞或組織樣品，使用適當的細胞裂解緩衝液（含有蛋白酶抑制劑）將樣品裂解以釋放蛋白質。
2、預處理樣品：
樣品可以透過超聲波處理或離心來破碎細胞核。新增二甲基亞碸（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）或其他交聯劑以穩定蛋白質-蛋白質相互作用。
3、抗體選擇：
選擇與您感興趣的泛素化底物特異性的抗體。通常使用泛素抗體（anti-Ubiquitin antibody）或特定底物的抗體。
4、免疫沉澱（IP）：
將所選抗體與蛋白質A/G瓊脂糖珠（Protein A/G agarose beads）或磁珠結合，形成抗體-珠複合物。再將抗體-珠複合物新增到細胞提取物中，以允許抗體與泛素化底物結合。透過旋轉混合或搖床培養樣品，使抗體與泛素化底物發生特異性結合。
5、洗滌：
使用洗滌緩衝液多次洗滌抗體-珠複合物，以去除非特異性結合的蛋白質。
6、蛋白質析取：
使用SDS-PAGE或其他蛋白質分離技術將沉澱的蛋白質分離。
7、Western blot分析：
首先,將分離的蛋白質轉移到膜上。使用特定的抗體探測目標蛋白質，以檢測泛素化水平。可以使用第二個抗體來檢測抗體-珠複合物中的抗體。透過Western blot分析，可以確定蛋白泛素化的程度，例如是否存在泛素化底物以及泛素化的程度。
圖2. Far-Western Blot分析
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