蛋白質磷酸化質譜分析

蛋白質磷酸化是由蛋白激酶和磷酸酶（PP）催化的一種翻譯後修飾，在許多細胞過程中發揮重要作用，包括細胞週期、生長、凋亡和訊號轉導途徑。爲了理解這些機制，有必要分析蛋白質磷酸化。

磷酸化分析的方法有很多，包括激酶活性測定、磷酸化特異性抗體開發、蛋白質印跡、酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 以及細胞內流式細胞術和免疫細胞化學/免疫組織化學 (ICC/IHC)。除了這些方法之外，質譜（MS）分析在磷酸化分析中也發揮著重要作用。透過自下而上的蛋白質組學鑑定蛋白質磷酸化位點有兩種常見策略，包括從單個蛋白質和小蛋白質複合物中鑑定磷酸化位點，以及從整個細胞和組織提取物中鑑定整體磷酸化位點。

識別特定目標蛋白質的磷酸化位點對於全面研究蛋白質磷酸化的功能作用非常重要，大致步驟如下：

1.樣品製備

由於磷酸化肽段與未修飾肽段相比具有較低的化學計量水平，因此需要儘可能多地純化蛋白質，以便成功進行液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）分析。這通常是透過使用FLAG、HA或Myc等表位標籤，或者使用適當的抗體進行免疫沉澱（IP）來完成的。此外，還可以透過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）或沉澱來純化蛋白質。爲了富集磷酸化肽段，有幾種方法可用，包括金屬離子親和色譜（IMAC）和二氧化鈦（TiO2）珠子。

2.透過 LC-MS/MS 進行分析

肽段可以透過與電噴霧電離（ESI）或基質輔助鐳射解吸/電離（MALDI）相結合的液相色譜引入到質譜儀中。肽段通常透過MS/MS使用碰撞誘導解離（CID）進行測序，與惰性氣體的碰撞使質子化的肽段在脊椎骨的醯胺鍵處斷裂。電子捕獲解離（ECD）和電子轉移解離（ETD）可以應用於磷酸化分析。

3.資料分析

需要使用資訊學軟體來識別肽段序列及其磷酸化對應物。一些資料庫搜索引擎是可用的，包括Mascot、Sequest、MaxQuant和X!Tandem。

爲了對整體磷酸化進行真正的比較分析，定量蛋白質組學策略是必要的。定量磷酸化蛋白質組學使研究人員能夠研究不同模型系統中的訊號通路，以識別因給定刺激而在丰度和持續時間方面發生變化的磷酸化事件。

磷酸化定量蛋白組學分析流程