質譜測泛素化位點
- 提取的蛋白質通常是大分子，需要切割成較小的肽段以便於質譜分析。
- 一種常用的蛋白酶是胰蛋白酶，它會識別特定氨基酸序列並將蛋白質切割成肽段。
- 切割後的肽段透過液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS/MS）進行分析。
- 在質譜儀中，肽段會被電離並根據質荷比（m/z）進行分離和檢測。
- 這會生成大量的質譜資料，包括肽段的質量、電荷狀態和碎片質譜資訊。
- 利用專門的質譜資料分析軟體，對獲得的資料進行處理和解釋。
- 軟體會識別肽段，並嘗試確定泛素化修飾的位置，通常是透過對肽段的質量變化進行分析。
- 進行定性和定量分析，以確定泛素化修飾的具體位置。
"泛素化位點"（Ubiquitination site）是指蛋白質上共價連線泛素的特定氨基酸殘基（通常是賴氨酸（Lysine）殘基，）及該氨基酸殘基在蛋白質中的排列位置。泛素是一種小分子蛋白質，能夠附加到其他蛋白質上，從而影響它們的功能、位置或降解。
質譜技術是測定泛素化位點的一種高效而精確的方法，透過質譜分析，可以識別被泛素化的蛋白質及其具體的泛素化位點。這種分析通常涉及蛋白質的酶解切割，然後透過質譜儀分析產生的肽段。大致的步驟如下：
一、蛋白質提取與純化：
首先，從細胞或組織中提取蛋白質，通常使用細胞裂解液來破壞細胞結構並釋放蛋白質。利用不同的分離和純化技術，如離心、超濾、免疫沉澱或親和層析，來富集泛素化蛋白，以便進一步的分析。
二、蛋白質消化：
三、質譜分析：
四、資料分析：
五、驗證與功能研究：
一旦確定了泛素化位點，通常需要進行生物學實驗來驗證這些位點的功能和生物學意義。這可以包括突變實驗、泛素化位點的敲除或過表達，以研究泛素化修飾對蛋白質功能、穩定性和互作的影響。
由於泛素化通常是瞬時和低丰度的修飾，因此需要採用適當的方法從複雜的生物樣品中富集泛素化蛋白或泛素化位點。例如，使用特異性抗體（如抗泛素抗體）或泛素結合結構域來富集泛素化蛋白。此外，選擇合適的酶來消化蛋白質對於暴露和檢測泛素化位點至關重要。通常使用胰蛋白酶（Trypsin）進行消化，但其他酶（如葡萄酶C）也可以用來提高檢測覆蓋率。
圖1.泛素化修飾研究路線
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