體外磷酸化打質譜
在體外磷酸化質譜分析中，首先將目標蛋白或蛋白混合物在實驗室條件下進行磷酸化處理。這通常是透過使用激酶和ATP來實現的。磷酸化後的蛋白質樣品隨後會經過質譜分析。質譜儀能夠精確地測量蛋白質或肽段的質量，並透過檢測磷酸化引起的質量變化來識別磷酸化位點。詳細步驟如下：
圖1.磷酸化定量蛋白組學分析流程
1.準備蛋白質樣品：
首先，需要準備目標蛋白質樣品。這可以是純化的蛋白質或者是複雜的細胞提取物。確保蛋白質質量和濃度適當。
2.磷酸化反應：
在體外磷酸化實驗中，蛋白質樣品會與激酶酶解藥物混合，以模擬細胞內的磷酸化反應。通常，磷酸化試劑中包含磷酸化底物（通常是ATP）、激酶酶和反應緩衝液。
3.反應停止：
反應一段時間後，通常使用某種方法停止磷酸化反應。停止方法通常包括加入熱凝膠樣品緩衝液或者加熱樣品，以使反應停止。
4.樣品分離：
磷酸化後的蛋白質樣品需要被分離，通常是透過SDS-PAGE電泳，以將蛋白質按照分子量分開。
5.染色和切割：
分離後的蛋白質在凝膠上染色，然後可以透過切割從凝膠中提取。目標蛋白帶會被切下來以備質譜分析。
6.質譜分析：
提取的蛋白質帶子可以進行質譜分析，通常是透過液相色譜質譜聯用（LC-MS/MS）來確定磷酸化位點。質譜資料將被分析以確定哪些賴氨酸殘基被磷酸化。
7.資料解釋：
分析獲得的質譜資料以確定蛋白質的磷酸化位點和磷酸化水平。這需要使用相關的分析軟體和資料庫來鑑定磷酸化位點。
體外磷酸化打質譜的關鍵優勢是它可以提供關於蛋白質磷酸化狀態和磷酸化位點的詳細資訊。透過比較磷酸化和未磷酸化的樣品，研究人員可以識別磷酸化事件的特定位點，以及這些修飾如何影響蛋白質的功能。
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