平行反應監測(prm)檢測泛素化
平行反應監測(Parallel Reaction Monitoring, PRM)是一種高解析度的質譜分析技術,常用於靶向蛋白質組學研究。它可以用於檢測和定量特定的蛋白質和蛋白質修飾,比如泛素化。
圖1
泛素化(Ubiquitination)是細胞中常見的蛋白質翻譯後修飾形式,透過這種方式修飾的蛋白質會連線一個或多個泛素蛋白。泛素化可以決定蛋白質的穩定性、定位、活性以及參與的細胞過程。
圖2
PRM監測泛素化的基本步驟包括:
1.樣品準備:
首先需要製備含有泛素化蛋白的樣品,這可能涉及細胞培養、蛋白質提取、泛素化位點的富集(可能透過免疫共沉澱等技術)等步驟。
2.肽段製備:
將蛋白質混合物透過酶(如胰蛋白酶)水解成肽段,這樣可以透過質譜分析每個肽段,而不是整個蛋白質。
3.質譜分析:
透過液相色譜(LC)將肽段分離後,利用質譜儀進行檢測。在PRM分析中,研究人員會預先設定一系列特定的肽段或者肽段的特定斷裂片段,這些目標是根據泛素化蛋白或特定泛素化位點的預期質量/電荷比來選擇的。
4.資料收集:
質譜儀會收集所有預定肽段的所有斷裂片段的資料,這是PRM與傳統的SRM(Selected Reaction Monitoring)技術的一個主要區別。SRM僅監測幾個預選的斷裂片段,而PRM則監測所有可能的斷裂片段,提供更全面的資訊。
5.資料分析:
透過對比實驗資料與已知泛素化肽段的理論質量和斷裂模式,確定樣品中存在的泛素化肽段,並進行定量分析。
PRM的優勢在於其高準確度和高靈敏度,這使得它非常適合於檢測低丰度的蛋白質修飾,如泛素化。此外,由於它收集目標肽段所有可能的斷裂片段,它可以提供有關泛素化位點和泛素化型別(如單泛素化還是多泛素化鏈)的詳細資訊。然而,PRM需要高解析度質譜儀,並且通常依賴於已知的目標肽段資料庫,這意味著它可能不適合探索未知的泛素化位點。
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