蛋白在某個位點的磷酸化水平檢測
- 提取蛋白樣本並進行SDS-PAGE電泳。
- 將蛋白轉移至膜上。
- 使用針對特定磷酸化位點的抗體孵育。
- 使用標記有熒光或化學發光的二抗進行定量檢測。
- 透過與總蛋白或載體蛋白的訊號進行歸一化，得到磷酸化水平的相對定量值。
- 提取並酶切蛋白樣本。
- 透過色譜方法富集磷酸化肽段。
- 進行LC-MS/MS分析。
- 使用特定的定量策略（如TMT、iTRAQ或標記自由方法）獲取磷酸化肽段的定量資訊。
- 與非磷酸化的對照組進行對比，得到相對或絕對的磷酸化水平。
- 在ELISA板上固定目標蛋白或肽段。
- 使用針對特定磷酸化位點的抗體進行孵育。
- 使用酶標記的二抗並加入底物進行顯色。
- 透過酶標儀讀取吸光度值，並與標準曲線進行比較，得到蛋白磷酸化水平的定量值。
磷酸化水平的定量分析在研究細胞訊號轉導、疾病發展及藥物作用機理中具有關鍵作用。特定位點的磷酸化水平反映了蛋白質的活性狀態及其參與的生物過程。以下是幾種用於檢測蛋白質某個位點磷酸化水平的方法：
圖1
1. 免疫印跡
使用特異性抗體可以定量蛋白的磷酸化水平。
步驟：
2. 質譜分析
利用LC-MS/MS可以提供蛋白磷酸化位點的絕對或相對定量。
步驟：
3. ELISA
使用ELISA試劑盒可以針對性地定量特定位點的磷酸化水平。
步驟：
檢測蛋白質某個位點的磷酸化水平是深入瞭解細胞功能和訊號轉導的關鍵步驟。不同的實驗目的和樣本型別可能會決定最適合的定量方法。而對於磷酸化水平的準確和可重複的定量，選擇適當的實驗設計和技術平臺至關重要。
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