蛋白定量測定
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樣品製備：細胞提取物、組織樣品、血清、血漿、尿液或其他包含蛋白質的生物樣品。確保樣品是乾淨的，沒有雜質。
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選擇測定方法：選擇適合你的實驗需求的蛋白定量方法。
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製備標準曲線：製備一系列已知濃度的標準樣品，需要標準曲線來測定蛋白質濃度。
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測定樣品：將樣品與測定方法中的試劑混合，按照方法要求的步驟進行反應。根據反應產物的顏色、吸光度或其他特性，使用分光光度計或其他相關儀器測量並記錄結果。
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計算蛋白質濃度：根據標準曲線或測定方法的公式，計算出樣品中的蛋白質濃度。
- 原理：這種方法基於柯馬斯亮藍G-250染料與蛋白質結合時所發生的顏色變化。
- 優點：操作簡單，靈敏度較高。
- 缺點：受到洗滌劑和其他化學物質的干擾。
- 原理：基於銅離子在鹼性條件下與蛋白質中的多肽鍵結合，並進一步與Folin-Ciocalteu試劑反應產生顏色變化。
- 優點：適用於較低濃度的蛋白質。
- 缺點：步驟比Bradford法更復雜，且易受其他物質的干擾。
- 原理：與Lowry 法類似，但使用BCA試劑，對銅離子和蛋白質反應更為敏感。
- 優點：適用於微量蛋白質的測定，穩定性好。
- 缺點：需要較長的孵育時間。
- 原理：蛋白質中的色氨酸和酪氨酸在紫外光下有特定的吸收峰。
- 優點：快速且不需要新增任何試劑。
- 缺點：對其他物質的吸收干擾敏感，需要較純淨的樣品。
- 原理：不使用化學標籤，直接透過分析肽段離子的強度或計數來定量蛋白質。
- 優點：操作簡化，適用於廣泛的樣品型別，無需額外的化學修飾。
- 缺點：對樣品製備和質譜操作的質量要求高，數據處理和解釋較為複雜。
- 原理：使用特殊的化學標籤對樣品中的蛋白質進行標記。在質譜中，標記產生特定的裂解離子，用於定量分析。
- 優點：可以同時分析多個樣本，提高了實驗的吞吐量。
- 缺點：高成本，數據處理複雜，對實驗設計和執行有較高要求。
- 原理：使用含有不同同位素的化學標籤對蛋白質或肽段進行標記，然後利用質譜分析比較不同樣本中蛋白質的相對丰度。
- 優點：提供了準確的蛋白質相對量比較，可用於複雜樣品。
- 缺點：成本較高，操作複雜，可能無法檢測未標記的蛋白質。
- 原理：基於資料獨立採集，透過系統地掃描所有預定質量視窗來收集質譜資料。
- 優點：提供高通量、高重複性的定量資訊，適合複雜樣品分析。
- 缺點：需要高階的數據處理技術，對儀器效能要求高。
- 原理：選擇特定的前體離子和產物離子對，用於定量特定肽段或蛋白質。
- 優點：高度特異性，靈敏度高，適合低丰度目標蛋白的定量。
- 缺點：每次只能定量有限數量的目標蛋白，需要事先知道目標蛋白的資訊。
蛋白定量測定是實驗生物學中一種常用的技術，用於測量樣品中蛋白質的濃度或總量。這種測定對於生物化學、分子生物學、醫學研究等領域非常重要。
圖1. 定量蛋白組分析
一、蛋白定量的基本流程包括：
二、蛋白定量的常見方法包括：
1、Bradford 蛋白質測定法：
2、Lowry 法：
3、BCA法（雙縮脲酸法）：
4、紫外吸收光譜法：
5、基於質譜技術的蛋白定量
1）無標記定量
2）iTRAQ/TMT
3）同位素編碼親和標記（ICAT）
4）SWATH-MS
5）多重反應監測（MRM）
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