基於Edman降解的蛋白N端序列分析

表達純化後的蛋白產物，特別是蛋白品的分析過程中，需要對蛋白的末端進行驗證，以保證表達純化產物的N端和C端序列準確。Edman降解法是蛋白的N端序列分析中非常成熟的方法之一，有著廣泛的應用。百泰派克公司採用島津公司Edman測序系統，為廣大科研工作者和科研客戶提供純化後蛋白產物、抗體以及蛋白疫苗的N端測序服務。採用我們的測序系統，可以測定N端30個氨基酸的序列資訊。採用特定的蛋白上樣系統，可以測定N端的60-70個氨基酸。百泰派克公司也建立了以先進的LC-MS/MS技術進行N-端測序的平臺，可以測出封閉和修飾的蛋白質末端，與Edman降解法形成互補，保證N端測序服務的順利進行。

在蛋白質測序前，蛋白樣品首先經過SDS-PAGE的分離，保證樣品的純度滿足測序的要求；隨後將SDS-PAGE上的蛋白樣品轉移到PVDF膜上；經過染色確定把蛋白條帶並切出；使用Edman測序儀對得到的PVDF膜上的蛋白樣品進行分析。Edman降解測序是透過迴圈反應從蛋白質的N端開始逐個鑑定氨基酸的種類，從而對蛋白質的N端序列進行測定。每一個Edman測序反應包括3步：第一步是在鹼性條件下，PITC與蛋白N端的遊離氨基結合；第二步是在酸性溶液中，N端殘基被切除；第三步是PITC結合的殘基轉化成為更為穩定的PTH殘基，經過線上的HPLC分析，根據洗脫時間確定氨基酸種類。

Edman測序反應過程

基於Edman降解的蛋白質N端測序服務流程

Edman測序實驗流程圖

應用領域

• 蛋白表達產物的驗證：重組蛋白插入位點和表達順序是否正確；
• 細胞株建立和發酵過程中蛋白產物的驗證：驗證細胞株建立和發酵過程中蛋白產物N端甲硫氨酸和訊號肽是否正確處理；
• 蛋白降解/酶切分析：對降解/酶切形成的新蛋白片段N端進行分析，確定斷裂/酶切位點；
• De-novo測序：對於蛋白資料庫中不存在的全新蛋白序列進行分析。

關於樣品

PVDF膜類樣品的準備過程
1.樣品電泳和電轉
a. 對蛋白樣品進行1D或者2D跑膠
b. 將蛋白膠上的樣品轉移至PVDF膜上；注意：千萬不要使用硝酸纖維素膜（Nitrocellulose membranes）
c. 在此過程中請佩戴手套和頭套，避免自身角蛋白對測序結果的影響

2.PVDF膜的染色
a. 染色過程中可以使用考馬斯亮藍或者立春紅對PVDF膜進行染色；注意：千萬不要使用銀染的方法進行染色
b. 染色完成之後，可以使用雙蒸水對PVDF膜進行清洗
c. 如果轉膜的緩衝液中含有甘氨酸，需要對PVDF膜進行多次沖洗，以避免甘氨酸對後續分析的影響
d. 更詳細的樣品準備步驟，見Edman測序樣品準備Protocol

3.靶蛋白條帶獲取
a. PVDF膜染色後，靶條帶清晰可見，用潔淨的解剖刀將靶蛋白條帶切下
b. 在蛋白量允許的情況下，可以準備2-3條靶條帶以增加靶蛋白的量

4.樣品運輸
對切下的蛋白條帶進行密閉包裝，使用冰袋運輸即可

溶液樣品的準備過程
1.蛋白的純度和用量
a. 樣品需要量在1-10 ug
b. 樣品純度要＞90%
c. Buffer中不要使用表面活性劑，並儘可能降低溶液的鹽濃度
d. Tris, glycine, guanidine, glycerol, sucrose, ethanolamine, SDS, Triton, X-100, Tween和其他的去垢劑，ammonium sulfate和其他的銨鹽均會對後續的氨基酸鑑定產生影響，在樣品準備過程中要避免使用
e. 樣品準備過程全程佩戴口罩和頭套，避免角蛋白的影響

2.蛋白樣品的運輸
a. 液體樣品推薦乾冰運輸
b. 液體樣品也可以在冷凍抽乾或者真空抽乾後，使用冰袋運輸

研究案例

如下圖所示，透過Edman測序，可提供鑑定的氨基酸的詳細資訊。

Edman測序研究案例

中/英文專案報告

在技術報告中，百泰派克會為您提供詳細的中英文雙語版技術報告，報告包括：
1. 實驗步驟（中英文）
2. 相關的質譜引數（中英文）
3. 蛋白質N端測序的詳細資訊
4. 質譜圖片
5. 原始資料