iTRAQ/TMT標籤結構以及相對定量原理詳解

    導讀
    • iTRAQ/TMT定量蛋白組學技術
    • iTRAQ/TMT標籤分子組成
    • iTRAQ/TMT技術原理

    iTRAQ和TMT標籤介紹
    說到iTRAQ和TMT很多人可能會以為這是兩中不同的定量組學技術,但其實呢,iTRAQ和TMT技術只是生產商不同,除了標記規格和標籤分子結構有些許差異,標記肽段的原理基本上是一樣的。其中iTRAQ由AB SCIEX所開發,緊接著Thermo Fisher研發了TMT,二者只是專利不同,但是使用原理基本一致。

    iTRAQ:Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation

    TMT:Tandem Mass Tag

    TRAQ和TMT標記實質上就是一種化學體外標記試劑,能夠特異性標記蛋白質酶解產生的多肽,並同時定量分析多組蛋白樣品

    iTRAQ-TMT標籤結構以及相對定量原理詳解-百泰派克生物

    iTRAQ和TMT標記實質上就是一種化學體外標記試劑,能夠特異性標記蛋白質酶解產生的多肽。iTRAQ和TMT標記的蛋白樣品規格不同,相比之下TMT能夠標記更廣泛的樣品數,能夠同時定量分析多組蛋白樣品,少至2個蛋白樣品,多至10個蛋白樣品,TMT蛋白定量都能夠做到。透過標記多組不同樣品,TMT和iTRAQ能夠同時比對正常組織樣品和腫瘤組織樣品的蛋白水平差異,以及精準檢測腫瘤在發展的不同階段的蛋白水平變化。

    雖然iTRAQ和TMT的標記原理一樣,但是兩種標籤的結構卻有一些差異,接下來我們來看看ITRAQ和TMT的標籤結構一個各自的細微差異吧

    iTRAQ與TMT的分子結構比較

    TRAQ和TMT標記實質上就是一種化學體外標記試劑,能夠特異性標記蛋白質酶解產生的多肽,並同時定量分析多組蛋白樣品。

    iTRAQ與TMT的分子結構比較

    從上圖來說,我們可以看到iTRAQ和TMT標籤在結構上有著明顯的差異,但是也有著一些共同點,首先兩個標籤都由報告基團,平衡基團以及肽反應基團組成,兩個標籤的各自報告基團和平衡基團的總重都是一定的。另外,兩個標籤的肽反應基結構也是一樣的。iTRAQ和TMT標籤的差異在於平衡基團的結構,從下圖可以看到TMT的平衡基團結構比iTRAQ標籤的更為複雜。iTRAQ標籤的平衡基團只有幾十Da,而TMT的平衡基團接近200Da,這也是造成iTRAQ和TMT標籤質量差異的原因。

    簡單介紹完兩個標籤的結構後,我們再以iTRAQ 4-plex標籤為例,詳細認識一下iTRAQ分子標籤的結構組成

    iTRAQ分子結構組成

    iTRAQ和TMT標記實質上就是一種化學體外標記試劑,能夠特異性標記蛋白質酶解產生的多肽,並同時定量分析多組蛋白樣品。

    iTRAQ 4-plex標籤結構

    iTRAQ標籤分子骨架由三部分核心元件構成:報告基團,平衡基團和肽反應基團。其中,報告基團和平衡基團構成等基團。不同的iTRAQ標籤的報告基團的重量不同,4-plex標籤的報告基團重量分別是:114,115,116,117Da;平衡基團的質量分別是:31,30,29,28Da,使得4個iTRAQ標籤的報告基團總重都是145Da。另外一個核心元件就是肽反應基團,其主要的功能就是與多肽遊離的N端氨基發生置換反應,使同位素標籤共價交連到肽段N端。
    前面說到標籤報告基團和平衡基團的質量,很多人可能會好奇,標籤的報告基團僅僅相差幾個Da,這是如何做到的呢?其實這就是利用了同位素標記的原理。下面我們以iTRAQ標籤為例進行解釋。

    如下圖,質量為114的報告基團包含1個C13,報告基團質量增加1Da。同時平衡基團包含1個C13和1個O18,質量總共增加3Da,因此,114標籤的總質量增加4Da。以此類推,115的報告基團增加2Da,平衡基團增加2Da;116的報告基團增加3Da,平衡基團增加1Da;117的報告基團增加4Da,平衡基團增加0Da。以上四個標籤透過對報告基團和平衡基團進行不同的同位素標記後,各自的報告基團和平衡基團的增加質量不同,但是增加的總的質量是一樣的,因此,標籤的總重相等。

    iTRAQ和TMT標記實質上就是一種化學體外標記試劑,能夠特異性標記蛋白質酶解產生的多肽,並同時定量分析多組蛋白樣品。

    iTRAQ標籤的同位素標記

    標籤與肽段反應的過程

    iTRAQ和TMT標記實質上就是一種化學體外標記試劑,能夠特異性標記蛋白質酶解產生的多肽,並同時定量分析多組蛋白樣品.

    肽段標記反應過程

    iTRAQ相對定量研究原理
    蛋白質首先被裂解為肽段,然後用iTRAQ試劑進行差異標記。由於iTRAQ試劑是等量的,即不同同位素在標記同一多肽後在第一級質譜檢測,分子量完全相同,用串聯質譜方法對在第一級質譜檢測到前體離子進行碰撞誘導解離,產物離子透過第二級質譜進行分析。在二級質譜分析過程中,報告基團、質量平衡基團和多肽反應基團之間的鍵斷裂,質量平衡基團丟失,產生低質荷比(m/z)的報告離子。由於二級質譜可分析相對分子質量相差1的報告基團,不同報告基團離子強度的差異就代表了它所標記的多肽的相對丰度。同時,多肽內的醯胺鍵斷裂,形成一系列 b 離子和 y 離子,得到離子片段的質量數,透過資料庫查詢和比較,可以鑑定出相應的蛋白質前體。

    TRAQ和TMT標記實質上就是一種化學體外標記試劑,能夠特異性標記蛋白質酶解產生的多肽,並同時定量分析多組蛋白樣品。


    iTRAQ定量分析原理


    iTRAQ相對定量研究流程

    iTRAQ和TMT標記實質上就是一種化學體外標記試劑,能夠特異性標記蛋白質酶解產生的多肽,並同時定量分析多組蛋白樣品。

    iTRAQ定量分析流程

    1. 對不同的蛋白質樣品進行酶切消化成多肽片段
    2. 使用不同的iTRAQ標籤對不同蛋白樣品消化產生的多肽片段分別進行標記,但是不同的iTRAQ標籤的總質量是一樣的。
    3. 比例混合各個標記後的樣品
    4. 帶上標記的多肽片段經過一級質譜分離,在一級質譜中,iTRAQ標籤由於總質量數一樣,來自不同蛋白樣品的相同肽段不能被區分,因此會一起進入二級質譜分析
    5. 在二級質譜中,在高能碰撞下iTRAQ的平衡基團會被打碎,因此報告基團得到釋放,同時肽段也被釋放,碰撞碎裂成二級碎片。這時透過分析肽段的氨基酸序列,可以推測對應的蛋白質的序列;同時各個報告基團的在質譜中的訊號強度代表多肽在4組樣品中的相對丰度,即反應相應的蛋白質在4組樣品中的相對錶達水平。

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