五種常用蛋白質組學定量分析方法對比

蛋白質組指的是一個生物體所表達的全套蛋白質。蛋白質組學本質上指的是在大規模水平上研究蛋白質的特徵，包括蛋白質的表達水平，翻譯後的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質水平上的關於疾病發生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識。生物質譜技術的出現和發展爲定量研究蛋白質組學分析提供了更可靠、動態範圍更廣的研究手段。

目前較主流的定量蛋白質組學方法有5種，分別是Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM(MRMHR)、和SWATH。

I. Label-free
Label-free，即非標記的定量蛋白質組學，不需要對比較樣本做特定標記處理，只需要比較特定蛋白肽段在不同樣品間的色譜質譜響應訊號便可得到樣品間蛋白表達量的變化，通常用於分析大規模蛋白鑑定和定量時所產生的質譜資料。




Label Free分析流程

Label-free定量方法操作簡單，可以做任意樣本的總蛋白質差異定量，但對實驗操作的穩定性、重複性要求較高，準確性也較標記定量差。因此，Label-free技術適合於大樣本量的定量比較，以及對無法用標記定量實現的實驗設計。

II. iTRAQ
同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ) 技術由AB SCIEX公司研發的一種體外同種同位素標記的相對與絕對定量技術。該技術利用多種同位素試劑標記蛋白多肽N末端或賴氨酸側鏈基團，經高精度質譜儀串聯分析，可同時比較多達8種樣品之間的蛋白表達量，是近年來定量蛋白質組學常用的高通量篩選技術。




iTRAQ分析流程

iTRAQ定量不依賴樣本，可檢測出較低丰度蛋白，且定量準確，可同時對8個樣本進行分析，適用於研究不同病理條件下或者不同發育階段的組織樣品中蛋白質表達水平的差異。

III. SILAC
SILAC即細胞培養條件下穩定同位素標記技術(Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture, SILAC)，其實驗流程是在細胞培養基中加入輕、中或重型穩定同位素標記的必需氨基酸(賴氨酸和精氨酸)，透過細胞的正常代謝，使新合成的蛋白帶上穩定同位素標籤。等量混合各型別蛋白質，酶解後進行質譜分析。透過比較一級質譜圖中同位素峰型的面積大小進行相對定量，同時二級譜圖對肽段進行序列測定從而進行蛋白鑑定。




SILAC分析流程


SILAC屬於體內標記技術，更接近樣品真實狀態，標記效率高達100%，且標記效果穩定，適合於全細胞蛋白分析，以及膜蛋白的鑑定和定量，每個樣本只需要幾十微克的蛋白量。

IV. MRM
MRM是一種基於已知資訊或假定資訊設定質譜檢測規則，對符合規則的離子進行訊號記錄，去除大量不符合規則離子訊號的干擾，從而得到質譜資訊的一種資料獲取方式，屬於目標蛋白質組。關鍵在於首先要能夠檢測到具有特異性的母離子，只將選定的特異性母離子進行碰撞誘導，從而去除其他子離子的干擾，只對選定的特異離子進行質譜訊號的採集。




MRM分析流程

MRMHR技術透過兩級離子選擇，排除大量干擾離子，使質譜的化學背景降低，目標檢測物的訊雜比顯著提高，從而實現檢測的高靈敏度，並具有重現性好、準確度高等特點，特別適合於已知蛋白質序列的蛋白質表達量差異驗證，可以檢測較低丰度的蛋白，但一次MRM實驗只能檢測到20個左右的目標蛋白。

V. SWATH
SWATH是瑞士蘇黎世聯邦理工學院的Ruedi Aebersold 博士及其團隊與AB-SCIEX於2012年聯合推出的一項全新的質譜採集模式技術，是 MS/MSALL技術的一種擴充套件。與傳統的shot-gun技術相比，SWATH採集模式能夠將掃描區間內所有的肽段母離子經過超高速掃描並進行二級碎裂，從而獲得完整的肽段資訊，是一種真正全景式的、高通量的質譜技術。




SWATH分析流程

如何選擇適合定量蛋白組學分析方法？
比較流行的是iTRAQ定量蛋白質組方法，該方法不依賴樣本，可以做任意樣本的總蛋白質的差異定量，而且定量準確。雖然Label-free同樣不限定樣本，但是定量準確度難以保障。SILAC是細胞層次的蛋白質組定量，而對組織的定量難度較大，並且SILAC培養費用高昂，不適合做商業化。MRM和SWATH都是目標蛋白質組相關的定量模式，但是SWATH可以完成數千種蛋白的定量，準確度極高，通量遠高於MRM，對於亞細胞結構、細菌、真菌、細胞分泌物等樣本，SWATH效果非常好，但SWATH價格相對較高。