用什麼實驗可以驗證蛋白與蛋白相互作用,如何進行?
一、共免疫沉澱（Co-IP）：
共免疫沉澱是一種用於研究蛋白質之間相互作用的實驗方法。實驗過程如下：
1.製備細胞提取物，含有待測蛋白質。
2.向細胞提取物中加入特異性抗體，靶向其中一個待測蛋白質。
3.將抗體與蛋白質孵育，使其結合。
4.加入蛋白A/G磁珠，與抗體結合。
5.透過磁力沉澱磁珠，以及與之結合的抗體和目標蛋白質。
6.洗滌磁珠，去除非特異性結合。
7.用SDS-PAGE溶液釋放蛋白質，並進行免疫印跡（Western blot）分析，以檢測目標蛋白質及其相互作用的蛋白質。
二、雙雜交（Yeast two-hybrid）：
雙雜交是一種利用酵母細胞遺傳系統研究蛋白質之間相互作用的方法。實驗過程如下：
1.將兩個待測蛋白質分別與酵母轉錄因子的DNA結合域（BD）和啟用域（AD）融合。
2.將這兩個融合蛋白質表達載體轉化到同一酵母細胞中。
3.在特定選擇性培養基上培養酵母細胞。
4.觀察酵母細胞的生長情況。如果兩個待測蛋白質相互作用，BD和AD將聚集在一起，啟動特定基因的轉錄，使酵母細胞在選擇性培養基上生長。
三、熒光共振能量轉移（FRET）：
1.熒光共振能量轉移是一種依賴於距離的熒光技術，可以用於研究蛋白質之間的相互作用。實驗過程如下：
2.將待測蛋白質分別標記為供體熒光染料和受體熒光染料。
3.將標記的蛋白質在適當的條件下混合，使其有機會發生相互作用。
4.使用熒光光譜儀或共聚焦顯微鏡測量熒光訊號。
5.如果兩個蛋白質相互作用，它們之間的距離將在一定範圍內（通常在1-10奈米），導致供體熒光染料向受體熒光染料轉移能量。這種能量轉移可以透過測量熒光強度變化或壽命改變來檢測。
四、生物層析法（Biolayer Interferometry, BLI）：
1.生物層析法是一種實時監測蛋白質之間相互作用的方法，基於光學干涉原理。實驗過程如下：
2.將一個待測蛋白質固定到感測器表面。
3.透過測量感測器上的光學干涉訊號，監測另一個待測蛋白質與固定蛋白質的結合過程。
4.記錄實時的結合曲線，可以用於計算蛋白質之間相互作用的結合常數和速率常數。
五、表面等離子共振（SPR）：
1.表面等離子共振是一種實時監測蛋白質相互作用的方法，基於表面等離子共振光學原理。實驗過程如下：
2.將一個待測蛋白質固定到感測器晶片表面。
3.透過測量感測器晶片上的表面等離子共振訊號，監測另一個待測蛋白質與固定蛋白質的結合過程。
4.記錄實時的結合曲線，可以用於計算蛋白質之間相互作用的結合常數和速率常數。
六、調控體系（TAP, Tandem Affinity Purification）：
1.調控體系是一種基於雙重親和純化技術的方法，可以用於鑑定蛋白質複合物。實驗過程如下：
2.將待測蛋白質與一個雙重親和標籤融合（例如，蛋白A和酵母酸性蛋白質，ProtA-TEV-ProtC）。
3.在生物體內表達融合蛋白質，然後提取細胞裂解物。
4.使用兩種不同的親和層析柱依次純化蛋白質複合物：首先，將裂解物透過蛋白A親和層析柱，與融合標籤中的蛋白A結合。接著用TEV蛋白酶切割融合蛋白質，釋放蛋白質複合物。然後將切割後的蛋白質複合物透過蛋白C親和層析柱，與融合標籤中的蛋白C結合。最後，洗脫純化的蛋白質複合物。
5.使用質譜（MS）或免疫印跡（Western blot）等方法分析蛋白質複合物成分，以確定蛋白質之間的相互作用。
七、荷包蛋白質互作實驗（LUMIER, Luminescence-based mammalian interactome）：
1.荷包蛋白質互作實驗是一種基於熒光酶報告的篩選技術，用於研究哺乳動物細胞中的蛋白質相互作用。實驗過程如下：
2.將待測蛋白質分別與熒光素酶（如Renilla熒光素酶）和免疫球蛋白結合蛋白（如Protein A）融合。
3.將融合表達載體轉染哺乳動物細胞，使待測蛋白質在細胞內表達。
4.提取細胞裂解物，將熒光素酶標記的蛋白質與免疫球蛋白結合蛋白標記的蛋白質混合。
5.用免疫沉澱法將免疫球蛋白結合蛋白標記的蛋白質沉澱下來。
6.檢測沉澱物中熒光素酶的活性。如果兩個蛋白質相互作用，熒光素酶活性會顯著增加。
這些方法都有其優缺點，可以根據實際需求和實驗條件選擇合適的方法來驗證蛋白質之間的相互作用。
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