iTRAQ/TMT實驗的主要步驟有哪些，主要採用哪些儀器？能得到什麼資料及什麼生物資訊分析結果？
- 差異表達蛋白質（DEPs）篩選：根據定量資料，識別在不同實驗條件下顯著差異表達的蛋白質。
- 富集分析：透過基因本體（GO）富集分析和通路富集分析（如KEGG通路），瞭解差異表達蛋白質在生物學過程、分子功能、細胞組分和代謝通路中的功能。
- 聚類分析：對差異表達蛋白質進行聚類分析，識別具有相似表達模式的蛋白質，這有助於發現潛在的功能相關性或共調控關係。
- 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網路分析：利用已知的蛋白質相互作用資料，構建差異表達蛋白質的網路，以揭示它們在細胞訊號和功能模組中的作用。
- 調控網路分析：透過結合轉錄因子、非編碼RNA等調控因子資訊，構建差異表達蛋白質的調控網路，揭示其上下游調控關係。
- 蛋白質功能預測：對新發現的差異表達蛋白質進行功能預測，如同源性搜尋、結構域分析和序列模otif分析等。
iTRAQ（isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation）和TMT（Tandem Mass Tags）是兩種同位素標籤方法，用於蛋白質組學實驗中的相對和絕對定量分析。它們的主要實驗步驟和使用的儀器如下：
1.樣品製備：
首先需要獲取目標細胞或組織，然後提取蛋白質。通常使用冷凍破碎、超聲波或者化學方法提取蛋白質。
2.蛋白質測定：
使用BCA、Bradford或Lowry等方法測定蛋白質濃度，以保證加入不同樣品的蛋白質質量一致。
3.蛋白質酶解：
將提取的蛋白質樣品用酶（如胰蛋白酶）進行消化，產生肽段。
4.肽段標記：
將酶解後的肽段與iTRAQ或TMT試劑進行標記。每個試劑與不同的肽段相結合，形成具有不同同位素組成的標籤。這些標籤在質譜中具有相同的質荷比（m/z），但碎裂時產生具有不同質荷比的報告者離子。
5.標記肽段混合：
將不同實驗組的標記肽段進行混合，形成一個複合樣品。
6.肽段分離：
使用高效液相色譜（HPLC）對混合肽段進行分離。通常採用基於反相色譜（RP-HPLC）的分離策略。
7.質譜分析：
將分離後的肽段透過液質聯用（LC-MS/MS）進行分析。常用的質譜儀器有Thermo Scientific的Orbitrap系列、SCIEX的TripleTOF系列以及Bruker的timsTOF系列等。
8.數據處理與生物資訊學分析：
對質譜資料進行資料庫搜尋、定量分析和統計分析。常用的軟體有MaxQuant、Proteome Discoverer、Skyline等。生物資訊學分析一般包括：
9.結果驗證：
根據iTRAQ/TMT實驗結果，選取一些關鍵蛋白質進行驗證實驗，如Western Blot、ELISA等。
iTRAQ和TMT實驗涉及樣品製備、蛋白質酶解、肽段標記、肽段分離、質譜分析、數據處理和生物資訊學分析等多個步驟。實驗結果可以幫助研究人員識別差異表達蛋白質，瞭解它們在生物學過程和代謝通路中的功能，並揭示其相互作用和調控關係。
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